第4章药物定量分析与分析方法验证

第四章药物定量分析与分析方法验证

石河子大学药学院

基本要求

一、掌握体外样品分析前处理方法二、掌握体内样品分析前处理方法三、了解定量分析样品的前处理方法的进展及在药物分析中的应用

第一节概述为什么要对定量分析的样品进行前处理？常规药物的主药，辅料新剂型药物的脂质体结构，微球骨架中药制剂的复杂组成生物药物浓度低，含有蛋白质等内源性物质减少干扰，提高灵敏度，专属性，准确度

第一节

定量分析样品的前处理方法

一、概述

1.不同结构的样品

卤素与芳环结合

含卤素有机药物

R-X（F，Cl,Br,I）卤素与脂肪链碳原子结合

含金属有机药物R-O-Me（有机酸或酚含金属有机药物金属盐；结合不牢固）

有机金属药物R-Me

（结合牢固）

常用的处理方法不经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法含卤素有机药物系指药物分子结构中所含卤素直接与芳环或脂肪链相连者，而不包括某些有机药物的卤酸盐或氢卤酸盐。结构特点：C—X（一）卤原子的活泼性1.卤原子与碳原子直接相连，卤原子的活泼性和它直接相连的烃基的结构有很大关系（1）乙烯型卤和芳卤不活泼（2）烯丙型卤和苄卤活泼（3）卤代烷型介于两者之间2.分子中所含卤原子的个数分子中所含卤原子的个数越多，活泼性越强，特别是同一碳上含多个卤原子或一个苯环上含多个卤原子时，活泼性增强更加明显。二、不经有机破坏的分析方法（一）直接测定法例如葡萄糖酸锌在水中溶解，直接释放锌离子。例如：富马酸亚铁

不溶于水，溶于热稀矿酸，释放亚铁离子，采用铈量法，邻二氮菲作指示剂（红色-蓝色）（二）经水解后测定法

1.用碱水解后测定法例如：三氯叔丁醇的含量测定

CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH(CH3)2CO+3NaCl+HCOONa+2H2ONaCl+AgNO3AgCl+NaNO3AgNO3+NH4SCNAgSCN+NH4NO3

△

原理三氯叔丁醇在氢氧化钠溶液中加热回流水解，氯元素全部转变成氯化钠，然后用剩余滴定法，即于水解液中加硝酸酸化，再加入定量过量的硝酸银滴定液，使Cl-生成AgCl沉淀，过量的硝酸银，以Fe3+为指示剂，用硫氰酸铵液回滴定。例:三氯叔丁醇的测定ChP（2000）（二）经水解后测定法

2.用酸水解后测定法例如：硬脂酸镁的含量测定

Mg(C17H35COO)2+H2SO4

MgSO4+2C17H35COOH

H2SO4+2NaOHNa2SO4

+2H2O

例

硬脂酸镁的测定ChP（2000）取本品约0.1g，精密称定，精密加硫酸滴定液(0.05mol/L)50ml，煮沸至油滴澄清，继续加热10min，放冷至室温，加甲基橙指示液1~2滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相当于2.016mg的MgO。1.碱性还原后测定卤素结合于芳环上时,由于分子中碘的结合较牢固,需在碱性条件下加还原剂（如锌粉）加热回流，使结合的卤素转变为无机的卤素离子，然后采用银量法（Fajans法）测定。（三）经氧化还原后测定法本法适用于测定结构中碘与苯环直接相连，且一个苯环上含多个碘原子的含卤素有机药物。例泛影酸的测定ChP(2000)取本品约0.4g，精密称定，加氢氧化钠溶液30ml与锌粉1.0g，加热回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤3次，每次15ml，洗液与滤液合并，加冰醋酸5ml与曙红钠指示液5滴，用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于20.46mg的C11H9I3N2O4。

USP(24)、BP（1998）

ChP(2000)收载的胆影酸、碘番酸、胆影葡胺、泛影葡胺、碘他拉酸等均采用同法测定。（三）经氧化还原后测定

2.酸性还原后测定例如：碘番酸的含量测定

醋酸酸性环境下，Zn还原后银量法

有机破坏金属原子，卤素与碳原子结合牢固者，用上述方法很难将有机结合的金属原子或者卤素转化为无机的金属化合物及卤素化合物，必须采用有机破坏的方法将药物分子破坏，将有机结合状态的金属，卤素等转变为可测定的无机化合物，方可选用合适的分析方法进行测定。

三、经有机破坏的分析方法

HNO3-HClO4法(一)湿法破坏HNO3-H2SO4法

H2SO4-硫酸盐法

HNO3-H2SO4-HClO4法；H2SO4-H2O2；H2SO4-KMnO4(二)干法破坏高温炽灼法

氧瓶燃烧法加Na2CO3或MgO以助灰化；温度控制在420℃

硫酸-硫酸盐法：常用于含砷或锑有机药物。硫酸钠为含水化合物，不利于有机破坏，采用硫酸钾。加入硫酸盐，提高硫酸沸点，破坏完全，防止分解。破坏得到的无机金属离子多为低价态！仪器：凯式烧瓶取样：10g生物样品：10-15ml尿样：50ml(二)干法破坏

适用于湿法不易破坏完全的有机物以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等）有机药物的破坏注意事项：（1）加热或灼烧时，应控制温度在420℃以下（2）一定要灰化完全（3）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但不要轻易弃去(三)氧瓶燃烧法（1）原理氧瓶燃烧法：将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定。适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析本法特点是简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析（2）仪器与材料

①仪器装置燃烧瓶为500、1000或2000ml无色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶；瓶塞空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状②称样用材料及称样

A.固体样品无灰滤纸

B.液体样品纸袋

C.软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包裹严密，外层再用无灰滤纸包裹④吸收液

A.作用：吸收液的作用是将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态③氧气B.吸收液的选择氟水

氯NaOH溶液溴H2O2-NaOHNaOH-硫酸肼饱和溶液碘NaOH－硫酸肼饱和溶液硫NaOH或H2O2

硒硝酸溶液（3）操作方法①燃烧瓶燃烧前的准备用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，将瓶口用水湿润，小心急速地通入氧气1min，立即用表面皿覆盖瓶口。②样品的准备取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。③样品的燃烧点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，俟燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液，同法另做空白试验。然后按各药品项下规定的方法进行鉴别、检查或含量测定。①根据被燃烧分解的样品量选用适宜大小的燃烧瓶。（4）注意事项

ChP（2000）规定的燃烧瓶体积为500、1000或2000ml三种，采用常量或半微量分析待分解样品量燃烧瓶的体积

3~5mg（微量分析）

150~250ml

20~30mg（半微量分析）

300~500ml

50~60mg

1000ml

0.6~0.7g或更多

2000ml或特殊结构的燃烧瓶正确选用燃烧瓶的目的在于：样品能在足够的氧气中燃烧分解完全；有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。②测定含氟有机药物时，用石英制燃烧瓶③铂丝燃烧时起催化作用④应同时做空白试验⑤燃烧时要注意防爆⑥燃烧要完全⑦燃烧产生的烟雾完全被吸收例碘苯酯的含量测定ChP（2000）原理碘苯酯系有机碘化物，用氧瓶燃烧分解，转变为碘化物，继而氧化为游离的碘，并被定量地吸收于吸收液中，和氢氧化钠反应，生成碘化物与碘酸盐，加入溴-醋酸溶液，使全部转变为碘酸盐，过量的溴以甲酸及通空气去除。加入碘化钾，使与碘酸盐反应析出游离碘，用硫代硫酸钠液滴定，碘与淀粉结合所显的蓝色消失即为终点。（5）应用应用示例：碘苯酯的测定第二节定量分析方法特点

一、容量分析法（一）容量分析法的特点

操作简单、快速；比较准确（RSD＜0.2%）；仪器普通易得。（二）容量分析法的计算问题

1.滴定度（T）的概念每1ml规定浓度（mol/L）的滴定液所相当的被测物质的量(mg)。2.滴定度的计算aA+bBcC+dD

T=m×a/b×M

3.百分含量的计算（1）直接滴定法D%=V×F×T/W×100%

F=实际标定的浓度/规定的浓度

（2）间接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）

D%=（VO–VB)×F×T/W×100%

二、光谱分析法

（一）紫外-可见分光光度法（200nm～760nm)灵敏度高，可达10-4g/ml～10-7g/ml1.特点准确度高，SRD（%）为2%～5%仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用范围广。2.朗伯-比耳定律A=ECLE1%1cm

的概念

3.仪器校正和检定

波长校正用汞灯中较强谱线237.38,253.65,275.28,296.73,313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm与576.96nm

或用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm进行校正。吸收度的检定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/LH2SO4液至1000ml

波长(nm)235(最小)257(最大)313(最小)350(最大)

E1%1cm124.5144.048.62106.6

杂散光检查：试剂浓度(g/ml)测定波长透光率(%)

NaI1.00220nm＜0.8NaNO25.00340nm＜0.84.对溶剂的要求:使用范围不得小于截止使用波长。220～240nm241～250nm251～300nm300nm以上溶剂+吸收池A＜0.40＜0.20＜0.10＜0.05

5.测定方法要求供试品溶液的A应在0.3～0.7对照品比较法：Cx=(Ax/Ar)Cr;含量%=Cx×D/W×100%

常用方法吸收系数法：含量%=(E1%1cm

)x/(E1%1cm

)r×100%

计算分光光度法（二）荧光分光光度法

灵敏度高，可达10-10g/ml～10-12g/ml

在低浓度进行测定，防止F与C不成正比及自熄灭作用1.特点用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减灵敏度高，但干扰因素多。

制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和选择性。用样品量少，操作简单，方法快速，应用范围较广。

2.荧光分析仪有二个单色光器—激发单色光器与发射单色光器；且激发光源、样品池和检测器成直角。3.含量测定常用的方法对照品比较法:Ci=(Ri-Rib)/(Rr-Rrb)×Cr

Ch.P收载地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。

三、色谱分析法

按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱按分离方法分为：PC；TLC；柱色谱；GC；HPLC。（一）HPLC法1.对HPLC仪器一般要求色谱柱、流动相按品种项下要求。色谱柱的理论板数：n=5.54(tR/Wh/2)22.系统性试验分离度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5拖尾因子：T=W0.05h/2d1

应在0.9～1.05

内标法加校正因子测定供试品中主成分含量3.测定方法

标准曲线法

外标法测定供试品中主成分含量外标一点法应用示例：RP-HPLC法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法如头孢拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法

（二）GC法1.对GC仪器一般要求载气为氮气；色谱柱为填充或毛细管柱色谱柱的理论板数：n=5.54(tR/Wh/2)22.系统性试验分离度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5拖尾因子：T=W0.05h/2d1

应在0.9～1.05内标法加校正因子测定供试品中主成分含量

3.测定方法

标准曲线法

外标法测定供试品中主成分含量外标一点法应用示例：Ch.P(2000)收载的月桂卓酮、维生素E及其片剂、注射剂、甲酚皂溶液等均采用GC法中的内标法加校正因子测定含量。

第三节药品质量标准分析方法验证一、准确度

是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示（一）含量测定方法的准确度1.原料药可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确度的另一方法测定的结果进行比较。2.制剂要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD。

具体做法：测定高、中、低三个浓度，n=3,共9个数据来评价回收率的RSD＜2%；用UV和HPLC发时，一般回收率可达98%～102%；容量法可达99.7%～100.3%

（二）数据要求

回收率%=（测定平均值—空白值）/加入量×100%要求制备高、中、低三浓度的样品，各测定3次。应报告已知加入量的回收率，或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。二、精密度

是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果之间的接近程度。

（一）精密度表示方法1.偏差(deviation,d)d=测得值-平均值=Xi-X

2.标准偏差（standarddeviation,SD或S）

S=[(∑Xi–X)2/(n-1)]1/23.相对标准差(relativestandarddeviation,RSD)也称变异系数(coefficientofvariation,CV)RSD=标准偏差/平均值×100%=S/X×100%（二）重复性、中间精密度及重现性1.重复性在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度.2.中间精密度在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度。3.重现性在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。（三）数据要求

应报告S或SD、RSD和可信限。用统计学的可信性分析(t或f）。

三、专属性是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性。

（一）鉴别反应应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应。（二）含量测定和杂质测定

色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。

图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。四、检测限（limitofdetection,

LOD)是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。（一）常用的方法

1.非仪器分析目视法用已知浓度被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。2.仪器分析方法

UV法：LOD=f.3S空=C样/A样×

3S空

Flu法：LOD=f.3S空=C样/(F样-F空)×

3S空

GC和HPLC法：

LOD=S/N=2或3

（二）数据要求应附测试图，说明测试过程和检测限结果。

五、定量限（limitofquantitation,

LOQ)

是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求

LOQ.常用信噪比法确定定量限，一般以S/N=10时相应的浓度进行测定。

六、线性

是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。

UV法：首先制备一个标准系列，浓度点n=5;A=0.3～0.7

建立回归方程C=aA+b;r＞0.9999。HPLC法：制备一个标准系列，浓度点n=5～7;以C对h或A或与内标物的峰面积之比，建立回归方程r＞0.9999。七、范围

是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间。

原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的80%～120%。

制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的70%～130%。

溶出度或释放度中的溶出量测定：范围应为限度的±20%。

八、耐用性

是指在测定条件下有效的变动时，测定结果不受影响的承受

程度。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。HPLC法变动因素有：流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。

GC法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。

分析方法效能指标的具体应用：1.用于鉴别试验的方法：只要求专属性、耐用性，其余不要求。2.用于原料药中杂质测定和制剂中降解产物测定的方法：①用于定量：除了检测限不要求外，其余七项指标均要求。②限度检查：除检测限、专属性、耐用性要求外，其余不要求。3.原料、制剂及溶出度测定：不要求检测限和定量限，其余均要求。准确度、精密度、专属性、检测限定量限、线性、范围、耐用性练习与思考[A型题]

1．药品的鉴别是证明A．未知药物的真伪B．已知药物的真伪C．已知药物的疗效D．药物的纯度E．药物的稳定性2．相对标准差表示的应是A．准确度B．回收率C．精密度D．纯净度E．限度3．用移液管量取的25ml溶液，应记成A．25mlB．25.0mlC．25.00mlD．25.000mlE．25±1ml4．以下三个数字0.5362、0.0014、0.25之和应为A．0.79B．0.788C．0.787D．0.7876E．0.85．表示两变量指标A与C之间线性相关程度常用A．相关规律B．比例常数C．相关常数D．相关系数E．精密度6．减小偶然误差的方法是A．做空白试验B．做对照实验C．做回收试验D．增加平行测定次数E．选用多种测定方法[B型题]

1～4A．1.23B．1.22C．2.54D．2.53E．2.511．1.22522．2.53513．2.53484．2.5068ACDE

5～8A．空白试验B．对照试验C．回收试验D．鉴别试验E．检测试验5．以同量的溶剂替代供试品同法进行测定试验6．在供试液中加入已知量的标准物或已知量的被测物后，同法进行测定试验7．用已知量的纯物质作为试样，同法进行测定试验8．取少许水杨酸，加水溶解，加三氯化铁试液，显紫堇色ACDB[X型题]1．药物分析方法的效能指标有

A．检测限B．耐用性C．准确度D．专属性E．代表性2．对药物中杂质进行限量检查时，要求所用的检查方法应具有

A．耐用性B．专属性C．检测限D．准确度E．线性与范围3．测定药物片剂的溶出度或释放度时，对所用测定方法应要求

A.精密度B.定量限C.耐用性

D.回收率E.检测限

4．系统误差来源于

A．分析方法B．所用试剂

C．操作者D．所用仪器

E．工作环境

5．消除系统误差的方法为

A．校正所用的仪器B．作对照实验C．做空白试验D．做预试验E．做回收试验6．以下所列仪器哪些使用前需进行校正

A．滴定管B．量瓶C．量杯D．移液管E．碘量瓶7．中国药典（2000年版）在正文部分的检查项下应包括

A．药物的真伪B．有效性C．均一性D．纯度要求E．安全性8．进行药品检验时，要从大量样品中取出少量样品应考虑取样的

A．多样性B．真实性C．代表性D．科学性E．可靠性9．用信噪比表示检测限时，信噪比一般应为

A．1∶1B．2∶1C．3∶1

D．4∶1E．5∶1

10．检验报告应有以下内容

A．供试品名称B．外观性状

C．检验结果、结论D．送检人盖章

E．报告的日期返回

第四节

生物样品分析方法的基本要求

一、常用样品的种类、采集和贮张二、生物样品分析前处理技术三、定量分析方法验证

在测定生物样品中药物及其代谢物时，一般要在测定前进行样品的前处理，即进行分离、纯化、浓集。

生物样品包括各种体液和组织，常用是血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液。

一般具有以下特点

（1）样品量少，浓度低

（2）干扰因素多

（3）药物浓度随取样时间而变化，且个体差异较大。（一）血样

血浆（plasma)和血清（serum)是最常用的生物样品。

测定血中药物浓度通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度。

一般认为，当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。1.取样：

供测定的血样应能代表整个血药浓度，因而应待药物在血液中分布均匀后取样。

动物实验时，可直接从动脉或心脏取血。

对于病人，通常采取静脉血，有时根据血药浓度和分析方法灵敏度。也可用毛细管采血。血样采量一般为1-2ml2.制备：

血浆的制备将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝素、草酸盐等）的试管中，混合后，离心，分离血细胞，上清液即为血浆。

肝素是一种含硫酸盐的粘多糖，常用其钠盐、钾盐，它能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白。一般lml的全血需加0.1—0.2mg的肝素，加入血样后立即轻轻旋摇，但勿太猛烈，以免导致血细胞破裂。

血清的制备血清是由血液中纤维蛋白原等影响下，室温放置，血液凝结，剥去血饼，离心后上层澄清黄色液体，经离心其量约为全血量的30％一50％。在室温高时，血凝过程进行得很快，宜在血凝后半小时内分离血清。当室温低时，血凝过程较慢，可将血液置37℃温度下加速血清析出。

血浆及血清中的药物浓度测定值通常是相同的。全血也应加入抗凝剂混匀，防止凝血。对大多数药物来说血浆浓度与红细胞中的浓度成正比，所以测定全血也不能提供更多的数据。全血的净化较血浆和血清麻烦，特别是溶血后，血色素等可能会给测定带来影响。通常用血浆或者血清中药物药物浓度代替。3.特点：

血样的采取量受到限制、间隔时间，采集方法：一般取1ml—2m1。用注射器、毛细管或微量采血管采取。血样的采血时间间隔应随测定目的的不同而异。

采取血样后，应及时分离血浆或血清，并立即进行分析。如不能立即测定时，应完全密塞后保存，短期冷藏（4℃），长期冷冻（-20℃）保存。（二）唾液

唾液的采集应尽可能在刺激少的安静状态下进行。一般在漱口后15min收集，采集10min。

采集后立即测量其除去泡沫部分的体积。放置后分为泡沫部分、透明部分及灰乳白色沉淀部分三层。分层后离心分离，取上清液作为药物浓度测定的样品。

可集中、单一部位采集。

唾液中含有粘蛋白，为阻止粘蛋白的生成，应将唾液在4℃以下保存，解冻后搅匀后再用，否则会产生误差。

优点：可以不受时间和地点的限制，很容易地反复采集，采集时无痛苦无危险；有些唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度。

例如：HPLC法测定唾液中依诺沙星。缺点：

唾液是各腺体分泌的的混合液体，其组成发生经时变动；因此，唾液中的药物浓度与血浆中的游离型药物浓度相比就容易变动；

唾液中药物浓度与血浆中药物浓度的比值(S/P)只有少数药物是恒定值；

有些与蛋白结合率较高的药物，药物在唾液中的浓度比血浆浓度低得多，需要高灵敏度的分析方法才能检测；

对有些患者（如癫痛二昏迷）不能采集唾液样品。（三）尿液

尿药测定主要用于药物剂量回收研究、尿清除率、生物利用度的研究。

体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物（conjugates）等形式排出。

尿液主要成分是水、含氮化合物（其中大部分是尿素）及盐类。

尿液中药物浓度较高，收集量可以很大，也方便，但尿液浓度通常变化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量，这就需要测定在规定时间内的尿液体积及尿药浓度，时间尿以外的尿不可能推断全尿中药物的排泄浓度和药物总量。

测定尿中药物的总量时，将一定时间内（如8h，12h或24h等）排泄的尿液全部储存起来，并记录其体积，取其一部分测定药物浓度，然后乘以尿量求得排泄总量。采集的尿液时，需用量筒准确地测量储尿量，并做好记录。

缺点：尿液中药物浓度与血药浓度相关性差；受试者的肾功能正常与否直接影响药物排泄，因而肾功能不良者不宜采集尿样；婴儿的排尿时间难于掌握；尿液不易采集完全并不易保存。

采集的尿样应立即侧定。若收集24h的尿液不能立即测定时，应加入防腐剂置冰箱中保存。常用防腐剂有：甲苯等，短时冷藏；长时冷冻。二生物样品分析其前处理技术

主要应考虑生物样品的种类，被测定药物的性质和测定方法三个方面的问题。

样品的分离、纯化技术应该依据生物样品的类型。例如，血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白；尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出。

根据被测定药物的结构、理化性质及药理性质、存在形式、浓度范围等，采取相应的前处理方法。

样品前处理方法随测定方法不同而不同，例如放射性免疫测定法具有较高的灵敏度和选择性，初步除去主要干扰物质之后即可直接测定，对于HPLC法为防止蛋白质等杂质沉积在色谱柱上，需要处理。

（一）去除蛋白质

目的：

可使结合型的药物释放出来，以便测定药物的总浓度；

去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能，延长使用期限。去除蛋白质方法：

1.加入与水相混溶的有机溶剂加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1:（1-3)时，就可以将90%以上的蛋白质除去，采用超速离心机（10000r/min)离心便可将析出的蛋白质完全沉淀。

2.加入中性盐使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。

常用的中性盐：饱和硫酸胺等。盐析的方法与有机溶剂提取法常并用，药物的回收率高。3.加入强酸

当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。常用的强酸有：10%三氯醋酸等。

含药物血清与强酸的比例为1:0.6混合，高速离心,就可除去蛋白质，取上清液作为样品。在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。

4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂

当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有：CUS04-Na2W04,ZnS04-NaOH等。含药物血清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分离后得上清液。5.酶解法

在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。

PH范围很宽，使蛋白质肽键降解，在50-60摄氏度具有最大活力。（二）缀合物的水解

尿中药物多数呈缀合状态。

含羟基、羧基、氨基和巯基的药物。可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷缀合物；

含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。

由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取，常用酸水解或酶水解的方法。酸水解时，可加入适量的盐酸液。对于遇酸及受热不稳定的药物，可以用酶水解法。常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或葡萄糖醛酸苷酶一硫酸酯酶的混合酶。（三）分离、纯化与浓集

1.液～液提取法（liquid-liquidextraction;LLE)多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质。

应用本法时要考虑所选有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积及水相的pH值等。