2020年分子生物学在检验医学中的应用参照模板课件

分子生物学在检验医学中的应用分子生物学在检验医学中的应用1

一、分子生物学在检验医学中的常用技术

1、

PCR技术2、

RT-PCR技术3、

RFLP4、

SSCP5、

MSP6、

测序

一、分子生物学在检验医学中的常用技术

2

二、外源性疾病的检验与诊断：

1、

细菌、支原体、衣原体、寄生虫、病毒等2、

SARS冠状病毒的分子生物学检测

二、外源性疾病的检验与诊断：

345BNIoutS/BNoutAs:

senseATGAATTACCAAGTCAATGGTTAC

antisenseCATAACCAGTCGGTACAGCTAC

FraGmentlenGth195bp

BNIinS/BNIAs:

senseGAAGCTATTCGTCACGTTCG

antisenseCTGTAGAAAATCCTAGCTGGAG

Fragmentlength110bp

SAR1s/SAR1as:senseCCTCTCTTGTTCTTGCTCGCA

antisenseTATAGTGAGCCGCCACACATG

Fragmentlength150bp

BNIoutS/BNoutAs:6Ampliconsequence(BNI-1,Bernhard-NochtInstitute,Hamburg,Germany)TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGACACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAAAACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC

Ampliconsequence(BNI-1,Bern7SARS-specificprimers:

Cor-p-F2(+)5'CTAACATGCTTAGGATAATGG3',

Cor-p-F3(+)5'GCCTCTCTTGTTCTTGCTCGC3',

Cor-p-R1(-)5'CAGGTAAGCGTAAAACTCATC3',

Productsize:

Cor-p-F2/Cor-p-R1:368bp

Cor-p-F3/Cor-p-R1:348bp

SARS-specificprimers:

Cor-p-8GovernmentVirusUnit

9/FPublicHealthLaboratoryCentre

382NAmCheongStreet

ShekKipMei

Kowloon,HongKongSAR

HongKong-SARChina

COR-1,COR-2:sense5'CACCGTTTCTACAGGTTAGCTAACGA3'

antisense5'AAATGTTTACGCAGGTAAGCGTAAAA3'

Productsize:310bpGovernmentVirusUnit

9/FPub9QueenMaryHospital

TheUniversityofHongKong

UniversityPathologyBuilding

HongKong-SARChina

HKU:sense5'TACACACCTCAGCGTTG3'

antisense5'CACGAACGTGACGAAT3'

Productsize182bpsQueenMaryHospital

TheUnive10

二、内源性疾病的检验与诊断：

1、

临床基因变异酶的分子性质研究

1）

用PCR-SSCP技术发现我国第一例LDH遗传变异病例

二、内源性疾病的检验与诊断：

11病例21岁男性：LDH：75U/L(参考范围：110-240U/L)其余指标均正常在三年的调查期间，LDH活力始终处于较低水平，在48-85U/L之间病例12经排除其它原因，如血中的抑制剂的存在、药物的影响等可能因素外，我们怀疑可能有遗传性的LDH变异。根据计算红细胞中H、M亚基的比值，初步断定为H亚基变异，采用合成的7对引物，分别扩增LDH基因中的7个外显子，然后用SSCP电泳法与正常人对照，发现变异发生在外显子4上，由此证明该病人的长期低酶活力是有基因变异引起的。经排除其它原因，如血中的抑制剂的存在、药物的13

2n2

3n3

4n4

5n5

6n6

2n142）LDH-A和LDH-B亚基遗传变异及

对检验结果的影响基因变异可导致酶分子组成结构发生变化，对酶活力和酶的物理化学性质造成影响，可给临床医生造成诊断陷阱(pitfall)，因为在不同疾病状态下，从相关联的组织器官中释放出的酶与预期的不同，病人血清酶活力不能完全反映各种疾病的状态，容易造成误诊。2）LDH-A和LDH-B亚基遗传变异及

对检15

LDH-A基因变异类型_________________________________________________变异位置DNA氨基酸置换影响—————————————————————————A-171CGA-TGAArg-Ter无义突变A-328GAG-TAGGlu-Ter无义突变A-81GAC-AACAsp-Asn外显子2丢失A-220AAA-GAALys-Glu电荷变化A-314CGT-TGTArg-Cys电荷变化A-20插入C移码突变A-128TGTTGT-TGTValVal-Val辅酶结合A-213丢失2bp(CT)移码突变A-251丢失20bp移码突变—————————————————————————LDH-A基因变异类型16

LDH-B基因变异类型

变异位置DNA氨基酸置换影响

B-6AAA-GAALys-Gly电荷变化B-35GCC-GAGAla-Glu辅酶结合B-1038bp重复移码突变B-131AGT-CGTSer-Arg辅酶结合B-139丢失2bp(TC)移码突变B-1454bp重复移码突变B-147TAT-TAGTyr-Ter无义突变B-171CGC-CCCArg-Pro基质结合B-172TTT-GTTPhe-Val基质结合B-173CGC-CACArg-HisP轴的安定性B-176ATG-TTGMet-Leu分子稳定性B-287丢失1bp(C)移码突变B-320GAT-GTTAsp-Val电荷变化

LDH-B基因变异类型17

3)

CK变异的分子性质及对酶活力的影响

病例56岁妇女，胸痛一天后被送入急诊科心电图和临床症状提示AMI实验室检查：LDH6900U/L(200-400U/L)LDH-1/LDH-21.72CK37U/L(15-130U/L)CK-MB0U/L

3)

CK变异的分子性质及对酶活力的影响

病例18RT-PCR结果RT-PCR结果1920外显子2残基54处A–GGAC–GGC天冬氨酸–甘氨酸

位于酶结构的第4个α-螺旋外显子2残基54处21

4）变异酶人群的检验结果不同于常

规人群的检验结果

结合临床研究发现变异酶的检验结果与常人存在着显著的差异，即这类人群发病前酶活力常低于正常人的参考范围，发病时则上升至正常人的参考范围之内，这个现象可能给临床医生正确诊断造成困难；

4）变异酶人群的检验结果不同于常

规221）

2、

2、电泳异常带的分子性质研究1）

231）

LDH异常电泳酶谱M4H1M3H2M2H3M1H4(+)LD-5LD-4LD-3LD-2LD-1

︱︱︱︱︱正常︱H缺失

︱M缺失︱︱︳︱︳︱︳︱︳H变异(slow)

︱︱︳︱︳︱︳︱︳H变异(fast)

1）

LDH异常电泳酶谱M4H1M24H发生变异时，产生H和hM4H1M3H2M2H3M1H4LD-5LD-4LD-3LD-2LD-1︱H1M3h1M3H2M2H4h2M2h1H3hHM2h2H2h3H1h4

H发生变异时，产生H和h2526272）

异常电泳酶谱的分子性质1）核苷酸的变异引起氨基酸的改变，2）变异后的氨基酸的酸碱性与变异前的氨基酸的酸碱性不同，3）变异的氨基酸位于分子的表面。

结果：产生异常的电泳结果2）

异常电泳酶谱的分子性质1）核苷酸的变28

3）

异常谱形的分析方法

3）

异常谱形的分析方法29LDH遗传变异和非遗传变异的分析流程图血清（浆）同工酶分析（异常形式）红细胞、白细胞同工酶分析正常谱型异常谱型免疫对流、固定、混合法鉴定遗传变异（H或M亚基变异）

（+）（-）

LDH-Ig复合物肿瘤产生LDH基因分析

LDH遗传变异和非遗传变异的分析流程图30LDHH/M比值的计算--------------------------------------------------------

LDH-1LDH-2LDH-3LDH-4LDH-5H亚基数43210M亚基数01234%ABCDE-------------------------------------------------------------------------------------------计算方法：H=A+3/4B+2/4C+¼DM=100-HH/M=H/(100–H)LDHH/M比值的计算-----------------31

2、

后生性调控标志物



2、

后生性调控标志物

321、DNA甲基化-后生性调控的主要方式

DNA甲基化是不改变基因序列，而是通过在DNA的CG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上加上甲基，从而调节基因的表达。1、DNA甲基化-后生性调控的主要方式3334

2）

启动子甲基化作为新的分子诊断

标志物的研究



2）

启动子甲基化作为新的分子诊断

3536

3）

启动子甲基化在分析LDH异常带

分子性质中的首例应用

病例4岁儿童遗传性Rb转移到颈淋巴结血清LDH升高异常同工酶带LD2ex位于LD1和LD2之间

3）

启动子甲基化在分析LDH异常带

373839404142

□□□□□□□□□□□□□□□□DNAmRNA1mRNA2aa0012345671234567□□□□□□□□□□□□□□□43449、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。9月-239月-23Sunday,September3,202310、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。13:29:3313:29:3313:299/3/20231:29:33PM11、越是没有本领的就越加自命不凡。9月-2313:29:3313:29Sep-2303-Sep-2312、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。13:29:3313:29:3313:29Sunday,September3,202313、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。9月-239月-2313:29:3313:29:33September3,202314、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。03九月20231:29:33下午13:29:339月-2315、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。。九月231:29下午9月-2313:29September3,202316、业余生活要有意义，不要越轨。2023/9/313:29:3313:29:3303September202317、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。1:29:33下午1:29下午13:29:339月-239、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。9月-239月-23Sunday,September3,202310、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。13:29:3313:29:3313:299/3/20231:29:33PM11、越是没有本领的就越加自命不凡。9月-2313:29:3313:29Sep-2303-Sep-2312、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。13:29:3313:29:3313:29Sunday,September3,202313、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。