上海市临检中心 PCR人员上岗培训班 课件2、PCR检测技术的分析前质量控制2016.3.21徐翀

PCR技术的基石1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构1962年获诺贝尔生理医学奖1956年，Kornberg阐明了DNA自我复制的分子机制，并在1957年鉴定了第一个DNA聚合酶1959年获诺贝尔生理医学奖1968年获诺贝尔奖的印裔学者Gobind

Khorana，他指导的博士后Kleppe等人原创性的发表了后来被称为PCR技术性文章Kleppe

K,

Ohtsuka

E,

Dleppe

R,

et

al.

Studies

on

polynucleotides.

XCVI.

Repairreplications

of

short

synthetic

DNA’s

as

catalyzed

by

DNA

polymerases.

J

Mol

Biol.1971;

56(2):

341-361.1969年Gordon

Conference

——Stuart

Linn——Karry

Mullis1977年，Sanger在PNAS上发表了题为“链末端终止DNA测序法”的文章，使用了寡核苷酸引物，DNA聚合酶和能终止反应引物延伸的、修饰过的核酸。Sanger

F,

Nicklen

S,

Coulson

AR.

DNA

sequencing

with

chain-terminating

inhibitors.Proc

Natl

Acad

Sci

USA.

1977;

74(12):

5463-5467.1980年，因建立了Sanger核酸测序而获得诺贝尔奖Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，……才木的文章Saiki

RK,

Scharf

S,

Faloona

F,

Mullis

KB,

Horn

GT,

Erlich

HA,

Arnheim

N.

Enzymaticamplification

of

beta-globin

genomic

sequences

and

restriction

site

analysis

fordiagnosis

of

sickle

cell

anemia.

Science.

1985

Dec

20;

230(4732):

1350-1354.Kary

Mullis的文章Mullis

KB,

Faloona

FA

.

Specific

synthesis

of

DNA

in

vitro

via

a

polymerase-catalyzedchain

reaction.

Methods

Enzymol.

1987;

155:

335-350.阿曼德·费根堡姆全面质量管理Mario

PlebaniUniversity-Hospital

of

Padova,

ItalyIFCC教育与管理部（EMD）实验室差错与患者安全小组（WG-LEPS）主席Analytical

factorspre-analytical

factorspost-analytical

factorsintra-analytical

factors%

of

total

errors46–68.218.5–47<15序号审核内容审核意见符基本符合不符合合但有缺陷暂不需评论与说明要考核标本管理实验室有各类患者准备、标本采 集、运送、接收（或拒收）、保存或安全处置的具体要求和操作规程标本运送应符合生物安全的要求， 组织标本应立刻冷冻并于低温条件下运送，标本采集、运送、接收全程可跟踪在接收标本时应有其状态的详细记录6.4

实验室应确定标本是否符合检测要求，拒收标本原因要明确6.5

标本检测全过程包括核酸提取、扩增、杂交、保存等都应保持标本的唯一编号6.6

实验室应对标本保存条件进行监控和记录纲领文件质量手册程序性文件支持文件第三层次：第四层次：作业指导书（标准操作规程）质量记录（表格、记录本等）证实监督文件质量体系文件层次图采集时间采集时间采集类型肝素使DNA抽提得率降低肝素在DNA提取过程中难以去除肝素使PCR扩增效率降低唯一编号 姓名 性别病历号采集时间接收时间标本类别标本状态□男□女月日时月日时□全血□□正常□□男□女月日时月日时□全血□□正常□□男□女月日时月日时□全血□□正常□□男□女月日时月日时□全血□□正常□□男□女月日时月日时□全血□□正常□姓名 性别病历号采集时间接收时间标本类别拒收原因拒收人签字送检人签字□男□女月日时月日时□全血□□正常□□男□女月日时月日时□全血□□正常□□男□女月日时月日时□全血□□正常□□男□女月日时月日时□全血□□正常□□男□女月日时月日时□全血□□正常□接收时间月日时标本类别拒收原因拒收人签字送检人签字姓名 性别病历号采集时间□男

月日时□女□全血□□正常□标本拒收原因：患者姓名或病历号不符标本容器为非不含任何添加剂的真空采血管采血量低于2ml标本采用肝素抗凝容器破损标本采集后送检时间超时标本重度或中度溶血标本脂血标本类型不正确（10）其它：时间长短根据报告单上的承诺而定病理样本处理对DNA提取的影响1．固定剂对DNA的影响固定剂的类型直接影响提取DNA的质量中性缓冲甲醛固定的标本，DNA保存完好，可以获得高分子量DNA。甲醛和戊二醛固定可使得DNA产量降低，醋酸甲醇（MAA）可导致DNA明显降解。乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。用AMex方法处理组织，既可保存许多抗原成分，亦可使大分子量DNA完好无损。病理样本处理对DNA提取的影响固定时间对DNA的影响不同标本对不同固定剂所需的最佳固定时间应摸索选定固定温度对DNA的影响加热到65℃时，氢键开始断裂；约90℃时，产生两条单链分子。在此变性状态下，甲醛与酸反应很快，通过羟甲基化作用可抑制DNA冷却后的再复性。通过应用缓冲