酿酒酵母总蛋白的提取及表达特性研究

酿酒酵母总蛋白的提取及表达特性研究

0工程技术应用母乳喂养在遗传和细胞生物学的研究中发挥着非常重要的作用，同时也是互补工程技术的重要组成部分。核酸药物是以核酸为作用靶点的药物,干扰或阻断细菌、病毒和肿瘤细胞的核酸合成,有效地杀灭或抑制细菌、病毒和肿瘤细胞1材料方法1.1企业地震产品制度酿酒酵母S.cerevisiaeBY4741(MATα;his3△1;leu2△0;met15△0;ura3△0);抗性菌株BY47411.2双酰甲基氨甲基pahs-3-甲基苯甲酰磺酸酯tki的合成YPD液体培养基(2%Tryptone,2%Glucose,1%Yeastextract);酵母完全合成(SC)固体培养基(0.17%YeastNitrogenBase,0.12%GlutamicAcid,0.2%Drop-outMix,1.5%Agar,2%Glucose);裂解缓冲液:8mol/L尿素,2mol/L硫脲,1%(w/v)二硫苏糖醇(DTT),1mmol/L苯甲酰磺酰氟(PMSF),1mmol/LNaF,35mmol/LTris,5mmol/LEDTA,DTT、PMSF、NaF临用前再加;牛血清蛋白(BSA);蜗牛酶;浓HCl;牛血清白蛋白(BovineAlbumin,BSA)均为分析纯;10%SDS;四甲基乙二胺原液(TEMED);30%丙稀酰胺;5×电泳液缓冲液;10%过硫酸胺(AP);1.0mol/LTris·HCl(pH6.8);磷酸盐缓冲液;1.5mol/LTris·HCl(pH8.8);PageRuler1.3tnbio高压细胞破碎高速离心机,UV-2100紫外分光光度计,超声波细胞粉碎机,TNBIO高压细胞破碎机,Tanon-3500凝胶成像系统,玻璃珠(Sigma,0.3mm),涡旋振荡仪,OLYMPUSBX53F相差显微镜,佳能EOS600D,垂直蛋白电泳仪。2测试方法2.1菌液光密度测定酵母细胞接种于50mLYPD液体培养基中培养,160r/min,30℃培养48h,在600nm处测定菌液的光密度(OpticalDensity,OD),使OD值达到OD2.2破碎离心液参照文献参考文献参考李聪等按照岳洪霞等参考文献[14]的方法。向离心管中加入4mL裂解液缓冲液,振荡混匀后,在功率0.75kW,压力150~180MPa的条件下,经25s一次性破碎,12000r/min离心10min,收集上清液。2.3化学方法参考贾艳萍等2.4破碎率检测的计算采用活菌显微镜直接计数法:式中:α为酵母细胞的破碎率;A2.5蛋白质含量测定采用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量2.6浓缩胶和分离胶对测定蛋白表达的影响采用不连续聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳,5.0%浓缩胶(pH6.8)和10%分离胶(pH8.8),上样量为每孔300μg蛋白。取一定体积实验样品和Marker上样,浓缩胶电压为80V,分离胶电压为120V。电泳结束后,进行G-250染色。3结果与分析3.1不同破碎方法对细胞破碎率的影响采用相差显微镜(OLYMPUSBX53F)对破碎前后的酵母菌混悬液进行细胞完整性观察,如图1所示。用细胞计数板对单位体积完整细胞计数。采用活菌显微镜直接计数法算出不同处理细胞破碎率,评价不同方法处理酵母细胞裂解效率。不同破碎方法处理样品细胞破碎率分别为:反复冻融法(44.59±4.49)%,超声波破碎法(67.21±1.43)%,酸洗玻璃珠法(81.25±0.91)%,高压破碎法(57.69±6.96)%,液氮研磨法(50.3±4.06)%,酶法(53±3.37)%。可知,酸洗玻璃珠法对酵母的细胞破碎率(81.25±0.91)%,比其他5种方法效率都高,反复冻融法细胞破碎率(44.59±4.49)%,其效率最低,其他依次为超声波破碎法>高压破碎法>酶法>液氮研磨法。酸洗玻璃珠法操作简便,样品间不会交叉污染,不需要高压设备,期间低温提取过程有利于蛋白充分溶解。采用高压细胞破碎仪破碎酵母,实验过程中样品损失较多。3.2反复冻融法与超声波法比较建立蛋白含量标准曲线,然后测定待测样品溶液的A由图2可知,在酵母细胞中,6种细胞破碎方法提取的总蛋白含量分别是液氮研磨法为68mg/mL,超声波破碎法125.67mg/mL,酸洗玻璃珠法152.67mg/mL,酶法132.67mg/mL,TNBIO高压破碎法111.67mg/mL,反复冻融法40.67mg/mL,其中酸洗玻璃珠法提取的蛋白含量最高,酶法相比于超声波破碎法和高压破碎法蛋白含量较高,可能是前者处理过程中有大量的酶蛋白的参入,而酶法破碎需要更长的时间才对细胞破碎有效果。通过测定280处吸光值,可间接反映细胞中总蛋白的释放情况以及酵母细胞的破碎程度,结合各种方法细胞破碎率结果,确定酸洗玻璃珠法作为在后续实验中提取酵母细胞蛋白的的方法。3.3对5-fpk-c细胞存在特征的分析酿酒酵母野生型菌株BY4741、抗性菌株BY4741酵母野生型菌株BY4741、5-FC抗性菌株B