利用半定量RT-PCR方法分析小麦

毕业论文（设计）题目：利用半定量RT-PCR方法分析小麦侵染叶锈菌后ATG8基因的表达学院：专业班级：学号：学生姓名：指导教师：2012年6月14日利用半定量RT-PCR方法分析小麦侵染叶锈菌后ATG8侵染叶锈菌后ATG8基因的表达摘要:以小麦稳定表达的微管蛋白基因(Tubulin)作为对照,利用半定量反转录聚合酶链式反应(Semi-QRT-PCR技术，对与抗叶锈病有关的小麦(TriticumaestivumL.)ATG8基因的表达进行了研究。结果发现在叶锈菌诱导不同时间后，ATG8基因在小麦品种5389叶片中的表达量基本不变；在小麦品种洛夫林10叶片中表达量出现变化，在接种后16hATG8基因表达量开始上升，在48h有所下降，之后又被诱导表达。研究表明，用半定量RT-PCR技术研究小麦基因表达，具有特异性高、操作简便和可靠性强的优点。关键词：小麦;ATG8基因；表达;微管蛋白基因；半定量反转录聚合酶链式反应ExpressionAnalysisofWheatATG8GenebySemi-QRT-PCRAbstract:Thestableexpressionofwheatmicrotubuleprotein(Tubulin)ascontrol，usingsemi-quantitativereversetranscriptionpolymerasechainreactiontechnique(Semi-QRT-PCR)，andthewheatleafrustresistance(TriticumaestivumL.)ATG8geneexpressionwerestudied.Theresultsshowedthattheleafrustinducedatdifferenttimes，theATG8geneexpressioninthewheatvarieties5389leavesbasicallyunchanged;inthewheatvarietiesLovrin10leaveschanged，aftervaccinationat16hATG8geneexpressionlevelbegantorise，at48hdeclined，afterbeinducedtoexpressagain.Theresultsshowthatsemi-quantitativeRT-PCRgeneexpressioninwheattechnology，withhighspecificity，simpleoperationandreliabilityadvantages.Keywords:wheat;ATG8gene;expression;microtubuleproteingene;semi-quantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction目录TOC\o"1-5"\h\z引言12材料和方法1试验材料1处理方法22.2.1小麦幼苗的培养与处理2总RNA提取与完整性检测22.2.3第一链cDNA的合成22.2.4Semi-QRT-PCR23结果与分析3ATG8基因PCR循环退火温度的确定3半定量RT-PCR循环数的确定43.3叶锈菌诱导下小麦Tubulin基因和ATG8基因在叶片中的表达44讨论5参考文献:5致谢错误！未定义书签。#1引言细胞自噬现象(autophagy)是真核生物所特有的，最早于1962年在显微镜下被发现，是细胞内的物质受自身溶酶体降解过程的统称。自噬作用发生后，细胞质中开始形成30一900nm的双层膜泡状结构，包裹着细胞器与细胞质，随后自噬小泡与溶酶体结合，自噬小泡中的物质在酸性环境下被降解。细胞内的物质主要有两种降解的途径，一种是通过蛋白酶体被降解，，另一种就是通过自噬的作用，蛋白酶体主要负责降解胞内的短寿命蛋白，而自噬负责长寿命蛋白和细胞器的降解再循环利用(Farre。tal，2004)。细胞自噬参与动植物体中的多种生理活动，例如细胞生长发育、细胞免疫、组织分化和对环境适应等等,有着十分重要的作用。细胞自噬的过程在进化上十分保守，从酵母、果蝇到脊椎动物和人都可以找到参与自噬作用的同源基因。对细胞自噬现象的研究最早是在酵母中进行的。到目前为止己经发现了20余个参与自噬过程的基因，其中近一半的基因在果蝇、线虫、哺乳动物等多细胞物种中都十分保守。2003年，Klions玲将这些自噬相关基因统一命名为ATG基因(AuTophaGy一related)，用来代表自噬相关基因和相对应的蛋白质。近年来由于分子生物学、基因组学等试验手段的日臻完善，尤其是酵母自噬突变株的产生，使得对自噬分子基础的研究有了很大的进展。ATG8编码的蛋白是自噬降解途径中的核心蛋白。通过化学合成或剔除ATG8能抑制自体吞噬［1］,从而阻止R0S积累和细胞死亡。这揭示了自体吞噬在细胞死亡中有很重要的作用机制［1,2］。半定量逆转录多聚合酶链式反应(RT-PCR,Reversetranscriptionpolymerasechainreaction)技术是近年来发展起来的探讨基因转录水平的有效手段⑶，Northern杂交是研究基因在转录水平表达的常规方法,一般以稳定表达的18srRNA作为对照［4］。Tubulin是植物中的一个稳定表达的“持家基因”,在研究大麦和大豆基因转录水平中,尤其在RT-PCR中常用它作为对照⑸。半定量RT-PCR方法以特异性高、操作简便和可靠性强的优点,与传统的Northernblot法比较,它具有灵敏、简捷、特异性高等优点,因此在检测基因的表达水平上得到了广泛的应用，在研究基因表达方面有逐渐取代Northern杂交的趋势。为了更深入研究小麦ATG8基因的抗叶锈病机制。本研究利用半定量RT-PCR方法，以小麦Tubulin基因作为内参，对小麦ATG8基因在各个不同时段中的表达进行了研究。材料和方法2.1试验材料本试验以抗(洛夫林10)、感(5389)不同的两小麦(TriticumaestivumL.)品种为材料，与叶锈菌(Pucciniareconditef.sp.tritic)i小种260分别组成不亲和和亲和组合。根据植物ATG8基因序列的同源性，设计PCR引物M99974和M99973。2.2处理方法2.2.1小麦幼苗的培养与处理将小麦种子播于直径15cm盛有培养土的花盆中，培养于人工培养室，昼夜温度为25°C/20°C,日光型镝灯照射，光照强度为400W/m2，光照周期为14h/d。在幼苗生长7天后（第一片真叶完全展开时），用毛笔蘸取叶锈菌小种260，均匀涂于叶表，再向叶面均匀喷雾，然后将幼苗置于保湿箱中黑暗保湿16小时，保湿后将幼苗移入培养室内继续培养。在接种后不同时间（0、8、16、24、36、48、72、96、120h）用液氮速冻的方式采集两片小麦叶片并放入-80C冰箱冷冻保存；小麦的叶片取自温室培养的人工接种叶锈菌260的“小麦品种洛夫林10”和“5389”材料。2.2.2总RNA提取与完整性检测总RNA的提取是RT-PCR反应中关键的第一步，因为RNA提取质量的好坏直接关系到后面cDNA的合成和PCR的扩增。因此所提的总RNA要求纯度高、完整性好并达到一定的浓度。其中在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是试验成败的关键［6］。将采集的幼叶液氮研磨，参照Trizol试剂盒（购自Invitrogen公司）说明书提取RNA。RNA完整性的检测:在1%普通琼脂糖凝胶上分离总RNA,根据分离条带的完整性和亮度估计其纯度和含量，如果含有比较完整的28SrRNA和18SrRNA条带，且28SrRNA条带亮度约是18SrRNA条带亮度的2倍，则说明获得的总RNA质量较好⑺⑻。2.2.3第一链cDNA的合成取等量不同时间段的总RNA,用MM-LV反转录酶反转录合成cDNA第一链，反转录PCR体系6pLRNA,6pLRNasefreeddH20,0ligodT18卩L,70°C、5min，冰上冷却，再加入5pLdNTP（2.5mmol/L）（购自Wolsen公司），5卩LRT缓冲液，RNasein2hibitor（购自TaKaRa）1pL,MM2LV反转录酶（购自Promega）1pL,42C反应1h,RT产物于-20C下保存。2.2.4Semi-QRT-PCR小麦Tubulin基因扩增根据小麦Tubulin基因序列，设计了一对特异性引物：正向引物5'-CTGAGAAACGGCTACCACAT-3'，反向引物5z-CCCAAGGTCCAACTACGAG-3，。PCR扩增采用10uL反应体系，分别加入等量的cDNA（0.5uL）模板，PCR缓冲液（10mmoloL的Tris2HCl,pH8.5~9.0,50mmoloL的KCl,0.1%的Triton2100）1uL,dNTP1uL,5'和3'端Tubulin基因特异引物各0.5uL,TaqDNA聚合酶0.2uL,蒸馏水6.3uL。反应在Perkin2Elmer9600热循环仪上进行。反应程序：94°C预变性3min,94°C变性30s,55°C退火30s,72°C延伸1min,25个循环；72C延伸5min。取等体积的PCR产物加上样缓冲液经1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色,紫外灯观察照相。小麦ATG8基因扩增根据已克隆的小麦ATG8基因序列，设计一对特异性引物，ATG8上游引物：5'-GCGTCGACATGGCCAAGACTTGCTTC-3',下游引物：5‘-CCGCTCGAGACACTTTCGGCTCTGCC-3引物由上海生工公司合成。PCR扩增加样量同上。反应程序：94°C预变性3min,94C变性30s,57C退火30s,72C延伸1min,32个循环；72C延伸10min。取等体积的PCR产物加上样缓冲液经1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯观察照相。结果与分析3.1ATG8基因PCR循环退火温度的确定以cDNA为模板,设置不同循环退火温度,用引物M99974和M99973进行PCR扩增。94°C3min,94°C30s,循环退火温度依次为50.0、52.8、55.5、62.0、63.8°C30s,72C延伸1min,32个循环；72C10min,电泳检测。图1：不同循环退火温度下ATG8基因的PCR结果Figure1：DifferentcyclicannealingtemperatureATG8genePCRresults.Marker50.052.855.562.063.8C注：循环退火温度在52.8C时出现杂带，在62.0C时条带太亮，最终选择循环退火温度为57C。Note：Thecycleannealingtemperatureof52.8°Conahybridwithbands,at62.0Ctoobright,thefinalchoiceofthecycletheannealingtemperaturewas57°C.

3.2半定量RT-PCR循环数的确定半定量RT-PCR是通过调整每个反转录产物即PCR模板的量使内标基因产量一致,来确定PCR过程中模板的用量，以确保不同批次反转录的cDNA的量相同。cDNA量相同，即可通过PCR扩增结果判断该目的基因在不同胁迫时间表达量的差异。在PCR扩增对数期,模板量与扩增产量成正比，而在PCR扩增后期其产量将不随模板量增加而增加⑼因此，需要做ATG8基因和内标基因不同循环数的PCR,在对数期内选择半定量RT-PCR的循环数。选择目的基因和内标基因的循环数分别为32和25。3.3叶锈菌诱导下小麦Tubulin基因和ATG8基因在叶片中的表达图2a：亲和组合(5389X260)ATG8基因扩增结果Figure2a:thecombinationof(5389X260)ATG8geneamplificationresultsTubulinATG816Figure2a:thecombinationof(5389X260)ATG8geneamplificationresultsTubulinATG8162436487296120(h)图2b：亲和组合(洛夫林10X260)ATG8基因扩增结果Figure2b:thecombination(Lovrin10X260)ATG8geneamplificationresultsTubulinATG8TubulinATG808162436487296120(h)用半定量RT-PCR方法对小麦ATG8基因进行表达分析，从图2a和图2b可以看出，小麦ATG8基因和Tubulin基因分别得到与预期片段大小一致的特异性扩增产物。Tubulin基因在叶锈菌诱导后不同时间的叶片中扩增条带亮度基本相同。以此为对照，分析了叶片中小麦ATG8基因在叶锈菌诱导后不同时间的表达变化。从试验结果分析，发现在叶锈菌诱导不同时间后，ATG8基因在小麦品种5389叶片中的表达量基本不变；在小麦品种洛夫林10叶片中表达量出现变化，在接种后16hATG8基因表达量开始上升，在48h有所下降，之后又被诱导表达。本试验进一步验证了以小麦Tubulin基因作为对照，利用半定量RT-PCR方法研究小麦基因表达的可行性。4讨论同时本研究证明了Tubulin基因在小麦不同组织中表达稳定，可以作为小麦基因表达研究的对照。半定量RT-PCR是目前研究基因转录水平的有效手段，可用来检测基因表达及其变化状况，并可进行定量分析，与传统的Northern杂交相比较，具有特异性高、操作简便、可靠性强的优点。在植物基因表达研究方面得到了广泛应用。万平等[10]以微管蛋白基因(Tubuli®为对照，利用半定量RT-PCR，研究发现小麦锌指蛋白基因(TazF)属于组成型表达基因。王维平等[11]以水稻肌动蛋白基因(Actin)为对照，利用半定量RT-PCR研究，发现水稻RCOI1基因的表达受茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导。同时半定量RT-PCR方法在病原体检测、转基因的安全检测及肿瘤的研究方面得到了广泛的应用[12]。运用半定量RT-PCR方法研究小麦基因在转录水平的表达，需注意以下几点：⑴总RNA和cDNA的质量。只有在总RNA未被降解的情况下,才能保证其中mRNA的完整性和随后反转录的cDNA质量，从而真实反映基因的表达。总RNA的定量。在反转录之前，作为起始模板各个样品中的总RNA量要一样，cDNA量和电泳PCR产物量也要一样，才能保证PCR扩增产物能真实反映基因表达的实际情况。引物的设计。要根据基因的非保守序列设计引物，以保证扩增的特异性。PCR循环数的确定。PCR扩增产物的量与循环数之间有一线性关系。前期的扩增产物量随循环数的递增而成比例增加。随着DNA聚合酶活性的下降和溶液中反应底物的消耗，扩增产物将达到一个平台。半定量分析的循环数应确定在成比例的线性关系范围内。表达丰度不同的基因半定量分析的PCR循环数亦不同。参考文献:LiYu*，FengyiWan*，SudeshnaDutta，SarahWelsh*，ZhiHuaLiu，EricFreundt*，EricH.Baehrecke，andMichaelLenardo*.Autophagicprogrammedcelldeathbyselectivecatalasedegradation[J].PNAS，2006，13：4952-4957.Ohsumi,Y.Nat.Rev.Mol[J].CellBiol，2000，2:211-216.CottrezF，AuriaultC，ApronA，etal.QuantitativePCR：validationoftheuseofmultispecificinternalcontrol[J].NucleicAcidaRes，1994，22(1):2712-2713.NIUJSH(牛吉山)，YUL(于玲)，MAZHQ(马正强)，etal.MolecularcloningandcharacterizationofaserineothreonineproteinkinasegenefromTriticumaestivum[J].AetaBotanicaSinica(植物学报)，2002，44(3):325-328(inChinese).HALTERMANDA，WEIF，WISERP.Powderymildew2inducedMlamRNAsarealternativelysplicedandcontainmultipleupstreamopenreadingframes[J