第一章微生物的纯培养和显微技术

第一章微生物的纯培养和显微技术第1页，课件共30页，创作于2023年2月第一节微生物的纯培养技术一.纯培养的分离方法（一）稀释法（二）平板划线分离法（三）单细胞（单孢子）挑取法（四）利用选择培养基分离法二.无菌技术三.微生物的保藏技术第2页，课件共30页，创作于2023年2月几个概念：纯培养技术：把特定微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的技术。纯培养（pureculture）：微生物学中将在实验室条件下，从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代，称为纯培养。混合培养物：含有两种以上微生物的培养物。二元培养物：只含有二种微生物，并保持二者之间特定关系的培养物。第3页，课件共30页，创作于2023年2月平板（cultureplate）：即培养平板的简称，指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。菌落（colony）：生长在固体培养基表面或内部，来源于一个细胞、具有一定形态结构的、肉眼可见的子细胞群体。菌苔（lawn）：众多菌落在固体培养基表面连成一片时，称为菌苔。第4页，课件共30页，创作于2023年2月一.纯培养的分离方法

（一）稀释法1.固体稀释倒平板法：将待分离材料作一系列稀释（1/10，1/100，1/1000，…），→取不同吸收液各少许与已熔化并冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，→摇匀后倾入灭菌过的培养皿中→凝固后保温培养一定时间→挑取单个菌落，重复以上过程→获得纯培养。第5页，课件共30页，创作于2023年2月第6页，课件共30页，创作于2023年2月2.涂布平板法：与上法相似，不同之处在于：先制平板→将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面→用无菌涂棒将菌液涂匀→培养→挑取单个菌落，重复以上过程→获得纯培养。第7页，课件共30页，创作于2023年2月3.液体稀释法：适于细胞较大的微生物待分离材料→接种于培养液中→培养→测定或估计单位容积中的含菌数目→稀至两、三滴液体中只含有一个微生物个体→每次取一滴至另一盛有新鲜培养基的试管中→摇匀，培养→观察→大多数试管无微生物生长，少数管底有一菌落，可能由一个细胞繁殖而来。第8页，课件共30页，创作于2023年2月

4.稀释摇管法：适于分离严格厌养菌。一系列盛由固体培养基的试管→加热熔化→冷却至50℃左右℃保温℃加入待分离材料进行梯度稀释→迅速摇匀→冷凝→倾注一层灭菌过的石蜡→培养→挑取单个菌落。；第9页，课件共30页，创作于2023年2月第10页，课件共30页，创作于2023年2月（二）平板划线分离法方法：制平板→用接种环沾取少许待分离材料→在培养基表面连续画线，随着接种环的移动，微生物得以分散→培养→在画线的后面部位可形成单独的菌落→挑取单个菌落→培养→获得纯培养第11页，课件共30页，创作于2023年2月第12页，课件共30页，创作于2023年2月（三）单细胞（单孢子）挑取法适用于分离混杂微生物中弱势群体。方法：（1）用显微操作仪在显微镜下用毛细吸管或显微针、钩、环等挑取→获得纯培养。（2）用一般显微镜，将一滴经适当稀释后的菌液置于载玻片上，选取只含有一个细胞的液滴进行纯培养的分离。此法多限于高度专业化的科学研究中采用。第13页，课件共30页，创作于2023年2月（四）利用选择培养基分离法1.抑制其它微生物的生长：控制pH、温度，加抗生素等

2.富集培养：光照、温度、高压、紫外线、氧气、营养等。通过设置有利于某些或某一微生物生长的特定条件，使适应该条件的微生物旺盛生长。此法易分离到某些特定微生物或弱势微生物。第14页，课件共30页，创作于2023年2月第15页，课件共30页，创作于2023年2月二.无菌技术1.常用器具的灭菌常用器具：试管、烧瓶、培养皿、涂棒、移液管、接种环等方法：这些器具在灭菌前须先进行包扎或装入特定容器中。（1）高压蒸汽灭菌0.1MPa121.3℃15~30min（2）高温干热灭菌160~170℃2h（3）烧灼灭菌第16页，课件共30页，创作于2023年2月2.培养基的灭菌：高压蒸汽灭菌过滤灭菌：适于不耐温的材料3.无菌操作：在火焰旁或无菌箱、超净工作台上操作。第17页，课件共30页，创作于2023年2月第18页，课件共30页，创作于2023年2月三.微生物的保藏技术（一）保藏目的在菌种一定时间内不死亡、不变异（丢失重要的生物学性状）、不被污染。（二）保藏原理根据微生物的生理生化特性，人工创造不适宜微生物生长繁殖的条件，降低代谢能力，以保持其遗传性、减少变异性，达到长期保藏的目的。休眠或半休眠第19页，课件共30页，创作于2023年2月（三）保藏方法

1.低温保藏法：（1）传代培养保藏(冰箱保藏法、定期移植法）（2）超低温保藏法液氮（-195℃）低温冰箱

2.干燥保藏法：沙土管保藏法

3.隔绝空气保藏法冷冻真空干燥保藏法第20页，课件共30页，创作于2023年2月第二节显微技术一.普通光学显微镜（一）油镜的工作原理

加油原因：

1.增加视野亮度

2.增加分辨率：最小可分辨距离=λ/2NANA=n.Sinα第21页，课件共30页，创作于2023年2月（二）使用方法第22页，课件共30页，创作于2023年2月二、暗视野显微镜观察细菌的运动性三、相差显微镜观察细微结构四、荧光显微镜特殊成分第23页，课件共30页，创作于2023年2月第24页，课件共30页，创作于2023年2月第25页，课件共30页，创作于2023年2月第26页，课件共30页，创作于2023年2月

第27页，课件共30页，创作于2023年2月五.电子显微镜以电子束为光源，因波长缩短，故分辨率提高。透射电镜的样品制备及观察：

1.金属网的处理载网200~400目的铜网

2.支持膜的制备塑料膜、碳膜、金属膜

3.将支持膜转移到至载网上

4.制片：滴液法、超薄切片法、复型法、冰冻蚀刻法等

5.观察

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第28页，课件共30页，创作于2023年2月第29页，课件共