聚合酶链反应(PCR)技术的基本原理及检测技术课件

聚合酶链反应（PCR）技术的基本原理及检测技术聚合酶链反应（PCR）技术的1内容概要概念和历史原理与体系分类特点注意事项内容概要概念和历史2

聚合酶链式反应的概念（PCR：PolymeraseChainReaction)是一个在体外（？）特异地复制一段已知/未知序列的DNA片段的过程，这项技术使人们快速从试管中获得大量拷贝的特异核酸片段

快速特异扩增得到大量核酸聚合酶链式反应的概念是一个在体外（？）特异地复制一段3叩响生命之门发现DNA双螺旋后67年大事纪叩响生命之门发现DNA双螺旋后67年大事纪4沃森和克里克在《自然》杂志发表文章提出DNA双螺旋结构，开启了分子生物学的辉煌时代沃森和克里克在《自然》杂志发表文章提出DNA双螺旋结构，开启5

科学家们先后确认了人体共有23对染色体，并发现了首个因为染色体缺陷导致的疾病-唐氏综合症。随后DNA的复制以及其传递信息的方式被发现科学家们先后确认了人体共有23对染色体，并发现了首个6

1970年，限制性内切酶的发现使得基因重组技术得以发展，从此打开了基因工程的大门。应用克隆转化的技术，成功生产出单克隆抗体，并应用于胰岛素的制备1970年，限制性内切酶的发现使得基因重组技术得以发7基因技术快速发展的阶段，先后出现基因指纹技术、基因复制技术、DNA重组技术、基因组图谱等基因技术快速发展的阶段，先后出现基因指纹技术、基因复制技术、81990年，人类基因组计划正式启动1997年，诞生了世界上第一只克隆动物-多莉羊2000年，人类基因组图谱绘制1990年，人类基因组计划正式启动92001年，人类蛋白组图谱启动2002年，疟原虫及蚊的基因图谱，水稻和小鼠的基因图谱蛋白质图谱的绘制等也陆续展开，基因芯片，二代测序和高通量测序技术、全基因组扫描等不断完善，蛋白和转录组学等2015年，奥巴马提出精准医疗2020年，SARS-COV2病毒大流行核酸确定为诊断金标准2001年，人类蛋白组图谱启动10中心法则基因组转录组蛋白组DNAProteinGenomeProteomemRNATranscriptome遗传信息载体功能执行体逆转录转录翻译中心法则基因组转录组蛋白组DNAProteinGenome11

Gene一mRNA—Protein—>>Metabolite系统生物学Gene一mRNA—Protein—>>Meta12“Jolie‘smother,actressandproducer,diedofovariancancerin2007attheageof56.Sheunderwentfurtheroperationonherovaryandovarianductsveryrecently.BRAC1

AngelinaJolie(安吉丽娜·朱莉)Undergoesdoublemastectomy05/15/2013CNN.com个性化医疗/精准医疗的标志性事件Geneticrisk87%risk-----breastcancer50%risk-----ovariancancer,“Jolie‘smother,actressandp13KaryB.Mullis（1944.12-2019.08.07）KaryB.Mullis（1944.12-2019.0814MichaelSmithPrizeshare:1/2MichaelSmith151990WilliamAllanMemorialAwardoftheAmericanSocietyofHumanGeneticsPreis

Biochemische

AnalytikoftheGermanSocietyofClinicalChemistryandBoehringerMannheim1991NationalBiotechnologyAwardGairdnerAwardR&DScientistoftheYear1992CaliforniaScientistoftheYearAward1993NobelPrizeinChemistryJapanPrizeThomasA.EdisonAward1994HonorarydegreeofDoctorofSciencefromtheUniversityofSouthCarolina1998InductedintotheNationalInventorsHallofFameRonaldH.BrownAmericanInnovatorAward2004HonorarydegreeinPharmaceuticalBiotechnologyfromtheUniversityofBologna,Italy2008BayBioLifetimeAchievementAwardSanFrancisco,CaliforniaAwardsandHonors1990WilliamAllanMemorialAwa16发现PCR的历程发现PCR的历程17DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸，并不断重复便可克隆tRNA基因但由于当时测序和引物合成的困难，Khorana的设想被人们遗忘了……一步之遥错失发现PCR的历程（1）Khorana错失机遇DNA的复制1971年，Khorana提出：经DNA变性，与18Mullis(1944-2019)，1983年春夏之交的一个晚上，在Cetus公司工作期间，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…突发奇想成大事很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，Mullis是其中之一发现PCR的历程（2）Mullis(1944-2019)，1983年春夏之交的一191983年，Mullis跟女友开车到乡下度假途中瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链自己的车和对面开来的车：DNA聚合酶面对面地合成着DNA，……1983年，Mullis跟女友开车到乡下度假途中20Mullis的第一个PCR实验1983年9月，Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保温。结果电泳上没有何条带。于是他用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带PCR技术的创建（3）Mullis的第一个PCR实验1983年9月，Mullis在21发现PCR的历程（4）1983年,KaryB.Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得以实现1988年Saiki等，引入Taq酶技术1989年，《Science》杂志列PCR为十项重大科学发明之首,1989年为PCR爆炸年1993年，Mullis获1诺贝尔化学奖2019年8月7日，Mullis仙逝，享年75岁发现PCR的历程（4）1983年,KaryB.Mull22内容概要概念历史原理体系分类特点注意事项内容概要概念历史23二、PCR技术的原理及反应体系1.PCR技术的基本原理最早称之为：无细胞分子克隆法在微量离心管中，加入适量的缓冲液，微量的模板DNA，四种dNTP，DNA多聚酶，一对引物（物质基础）通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍（反应过程）一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍；扩增了特异区段的DNA带（结果）二、PCR技术的原理及反应体系1.PCR技术的基本原理最早241234522557294时间（min）温度（℃）2.PCR的反应过程适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍1234522557294时间（min）温度（℃）2.PC25PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件1234522557294时间26PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点56℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件56℃引物1引物2DNA引物27PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件引物1引物2DNA引物72℃T28PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件72℃第1轮结束第2轮开始29PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件95℃TaqTaqTaqTaq30PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件72℃第2轮结束313.PCR技术的特点高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍皮克(pg=10-12)甚至单个拷贝扩增到微克(μg=10-6)水平3.PCR技术的特点高度的灵敏性30轮循环扩增量达23032高特异性引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键引物设计的最重要原则：最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增PCR技术的特点高特异性引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR33应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列引物长度以15-40bp为宜碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%引物内部避免形成二级结构两引物间避免有互补序列引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制引物设计原则应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列引物设计原则343’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列35操作简便易行PCR扩增法，只需数小时，就可用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列传统的DNA扩增法是分子克隆法，首先要构建含有目的基因的载体，然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选；这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程，操作复杂，一般需要数天到数周时间PCR技术的特点操作简便易行PCR扩增法，只需数小时，就可用电泳法检出1μg36血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA，如新冠病毒RNA的检测，有些试剂盒可以无须抽提直接检测对标本的纯度要求低PCR技术的特点血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA，374.PCR的反应体系和注意事项PCR经（1）高温变性、（2）低温退火和（3）中温延伸三步，Tap多聚酶以dNTP为原料，以引物为复制的起点，合成新链如此重复循环,经每次拷贝数放大一倍的

20～30次循环，待测基因片段放大了数百万倍

扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯下肉眼

能见到扩增特异区段的DNA带/或者其它检测技术进行后续分析和研究4.PCR的反应体系和注意事项PCR经（1）高温变性、（238PCR的反应体系总体积1~100μlBuffer缓冲液dNTP原料Primer引物DNA分子模板TaqDNA聚合酶PCR的反应体系总体积1~100μlBuffer缓冲液dNT39PCR技术的基本过程(1)模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5min基本过程PCR技术的基本过程(1)模板DNA预变性模板DNATa40PCR技术的基本过程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循环仪94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7minPCR技术的基本过程(2)Taq酶循94℃Taq酶7241琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)测序酶切克隆DNA/RNA/蛋白杂交小分子探针……..琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)测序42PCR反应体系中的成分单、双链DNA均可不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类一般1-100ngDNA模板/100μL模板浓度过高会导致非特异性增加过低，无扩增，假阴性模板PCR反应体系中的成分单、双链DNA均可模板43提取的核酸即可作为模板用于PCR反应临床检测标本，也可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA提取的核酸即可作为模板用于PCR反应44引物浓度通常10-100pmol/L过高，易导致模板与引物错配，特异性下降产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计合适的引物，用PCR就在体外大量扩增注意引物聚合体的影响引物浓度通常10-100pmol/L450.5-2.5U/50μl两种TaqDNA聚合酶天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成一个PCR反应约需酶量～2.5U/100μl过高，非特异性扩增；过低，产物量减少Taq

DNA聚合酶0.5-2.5U/50μlTaqDNA聚合酶46

dNTP

所需浓度取决于需要扩增片段的长度一般用等浓度的四种dNTP混合过高，易产生错误碱基的掺入过低，降低反应产量

dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性dNTP所需浓度取决于需要扩增片段的长度47dNTP的质量与浓度与

PCR扩增效率有密切关系dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，缓冲液调pH到7.0-7.5，小量分装，-20℃冻存，避免多次冻融扩增体系中dNTP应为50-200μmol/L，等摩尔配制，如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），易引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低dNTP的质量与浓度与PCR扩增效率有密切关系48Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂49（1）变性－双链DNA解链为单链：温度：94oC20-30秒（2）退火：温度由引物长度和GC含量决定增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性（3）延伸－时间由扩增片段长度决定温度：70-75℃,一般为72℃（4）循环次数：主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加

循环参数循环参数非一成不变，科学和灵活的应用（1）变性－双链DNA解链为单链：温度：94oC20-3050经典循环参数（500bp以内）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever经典循环参数（500bp以内）94℃30515）PCR反应条件的选择PCR反应条件包括:温度时间循环次数5）PCR反应条件的选择PCR反应条件包括:52温度与时间的设置设置变性-退火-延伸三个温度点标准反应：三温度点法：90～95℃模版变性40～60℃引物退火并结合到靶序列上，70～75℃模板延伸二温度点法：对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸温度与时间的设置设置变性-退火-延伸三个温度点53变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致失败的最主要原因一般93℃～94℃l

min足以使模板DNA变性若低于93℃则需延长时间但温度不能过高，因为高温对酶的活性有影响此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，可能会导致PCR失败或者效率降低变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致失败的最主要原因54退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至40℃～60℃，引物和模板结合退火温度与时间，取决于引物长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想

退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素退火(复性)温度与时55Tm值（解链温度）

指把DNA的双螺旋结构解链一半时的温度，亦即变性时，

紫外吸收值达到最大值的50%时的温度

。当核酸达到Tm值时，其260nm吸收量可增加百分之四十长度低于25mer的引物：Tm=4oC（G+C）＋2oC（A+T）更长的引物：Tm=81.5+16.6xLog10[Na+]+0.41(%GC)–600/sizeTm值内，较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性复性时间：一般30-60秒，足以使引物与模板之间完全结合可通过以下公式帮助选择引物的退火温度Tm值（解链温度）可通过以下公式帮助选择引物的退火温度56延伸温度与时间TaqDNA聚合酶的生物学活性：

70-80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃时，DNA合成几乎不能进行延伸温度与时间TaqDNA聚合酶的生物学活性：

57延伸温度与时间延伸温度：一般在70～75℃，常用温度为72℃，过高不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）3～4kb的靶序列需3～4min扩增10Kb需延伸至15min延伸进间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些延伸温度与时间延伸温度：一般在70～75℃，常用温度为72℃58循环次数循环次数—决定PCR扩增程度循环次数—主要取决于模板DNA的浓度循环次数：选在30～40次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多循环次数循环次数—决定PCR扩增程度59内容概要概念历史原理体系分类特点注意事项内容概要概念历史60三、常见的PCR技术名称主要用途简并引物扩增法扩增未知基因片断巢式PCR提高PCR敏感性、特异性，分析突变复合PCR同时检测多个突变或病原反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变单一特异引物PCR扩增未知基因组DNA单侧引物PCR通过已知序列扩增未知cDNA锚定PCR分析具备不同末端的序列增效PCR减少引物二聚体，提高PCR特异性固着PCR有利于产物的分离三、常见的PCR技术名称主要用途简并引物扩增法扩增未知基61基于扩增基础的分子诊断技术及其应用1983年后的37年里，扩增DNA的技术成为分子诊断应用最广的技术之一，发展变化了数十种核酸扩增检测技术根据DNA被扩增的过程中是变温还是恒温方式，可以将核酸扩增技术分为两类，温度循环式的扩增技术，常规PCR和实时定量PCR（RT／Q-PCR）等温方式的扩增技术，以核酸序列扩增法（nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）、转录介导的扩增（Transcription-mediatedamplification，TMA），环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）等技术为主。基于扩增基础的分子诊断技术及其应用1983年后的37年里，扩62一、温度循环式的扩增技术常规PCR：反应结束后对产物进行电泳、杂交、测序等方式分析，常与其他技术的结合衍生出多种分析方法，如：结合限制性长度多态性（PCR-RFLP）、结合特异性寡合苷酸探针

斑点杂交（PCR-ASO）、结合变性梯度凝胶（PCR-DGGE）、

结合单链构象多态性（PCR-SSCP）等分析技术RT-PCR：病原体的多重PCR（MultiplexPCR），提高敏感性和

特异性的巢式PCR（nestedPCR），研究基因表达的原位PCR

（insituPCR），分析RNA的逆转录PCR（RT-PCR）以及锚定PCR、不对称PCR、膜结合PCR等等一、温度循环式的扩增技术常规PCR：反应结束后对产物进行电泳63名称主要用途膜结合PCR去除污染的杂质或PCR产物残留表达盒PCR产生合成或突变蛋白质的DNA片断连接介导PCRDNA甲基化分析、突变和克隆等RACE-PCR扩增cDNA末端定量PCR定量mRNA或染色体基因原位PCR研究表达基因的细胞比例等臆断PCR鉴定细菌或遗传作用通用引物PCR扩增相关基因或检测相关病原信使扩增表型分型同时分析少量细胞的mRNA名称主要用途膜结合PCR去除污染的杂质或PCR产物残留表达盒64荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法I.普通荧光定量PCR荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利65常用的荧光标记方法可简单分为两大类：非特异检测——双链DNA内插式荧光染料

代表是SYBRGreen荧光染料扩增序列专一检测——主要指荧光探针

TaqMan探针和分子信标MolecularBeacon荧光染料：成本低廉，实验设计简便探针杂交：原理上严格，数据特异性高、更为精确

常用的荧光标记方法可简单分为两大类：荧光染料：成本低廉，实验66RealtimePCR的特点在定性PCR技术上发展起来的核酸定量技术实现了对DNA模板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强能实现多重反应让自动化程度成为可能避污染性、具实时性和准确性等特点RealtimePCR的特点在定性PCR技术上发展起来的67RealtimePCR利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析Opticon本底期、指数扩增期、平台期

RealtimePCR利用荧光信号的变化实时检测PCR扩6869Real-timePCR与普通PCR的区别

可定量结果采用闭管检测，不需PCR后处理，扩增和检测一次同时完成不需开盖，不产生污染探针与被检DNA序列特异杂交，增强了特异性光谱分析仪直读结果，自动分析，增强了灵敏性和客观性69Real-timePCR与普通PCR的区别可定量结果69RealtimePCR原理荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段

荧光信号指数扩增阶段：PCR产物量的对数值与起始

模板量之间存在线性关系平台期：关系复杂为了定量和比较的方便，在RT-PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值RealtimePCR原理荧光扩增曲线可以分成三个阶段：70ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标

准(即PCR扩增产物量的标准)Ct值中的C代表循环数(Cycle),t代表阈(threshold)Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所

经历的循环数ThresholdlineC(t)valueC(t)71

荧光信号阈（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值真正的信号:荧光信号超过阈值荧光信号阈（threshold）：72为什么用Ct值定量而不用终点相对荧光强度定量相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图

Ct值的重现性为什么用Ct值定量而不用终点相对荧光强度定量相同模板在同一73

软件自动利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线.未知10410310610510210RealtimePCR如何定量？软件自动利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过未74初始DNA量越多,荧光达到域值时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量确定初始模板的浓度初始DNA量越多,荧光达到域值时所需要的循环数越少确定初75RealtimePCR荧光探针①非特异性标记

SYBRGreenIRQ②特异性的荧光探针

MolecularBeacon

③TaqManRealtimePCR荧光探针①非特异性标记RQ②特异性76①非特异性标记：SYBRGreenI

扩增产物的荧光标记原理5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission延伸结束，形成双链DNA，此时sybrgreen结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发是，会发射出荧光－－检测时机在延伸结束时①非特异性标记：SYB77SYBRGreenSYBRGreen78SYBRGreenI熔解曲线分析温度荧光强度Tm荧光强度的变化是由于温度不断升高，双链DNA解离，SGI游离；Tm是熔解曲线的特征值，为DNA解链一半时的温度SYBRGreenI熔解曲线分析温度荧光强度Tm荧光强79融解曲线的作用Non-specificproductAmplicon判断PCR产物的特异性；排除非特异性扩增产物的干扰融解曲线的作用Non-specificproductAmp80②特异性荧光探针：MolecularBeacons茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对荧光基团淬灭基团分子信标（molecularbeacon）是一类能形成发夹结构(或者叫茎环结构)的探针，序列两末端序列互补（5-8bp左右），中间环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补。探针一端标记报告荧光基团，另一端结合淬灭基团

②特异性荧光探针：MolecularBeacons茎由81

当探针游离呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离上接近，荧光基团激发的荧光能量被淬灭基团吸收而使检测探头无法检测到当互补序列出现时，探针与DNA杂交，探针转变成一个开放的线性结构，报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产从而产生可被检测到的荧光

当探针游离呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基团82延伸:没有荧光MolecularBeacons延伸:没有荧光MolecularBeacons83MolecularBeaconsSNPTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQ荧光素目标序列茎淬灭剂MolecularBeaconsSNPTACCGGGGG84③TaqMan探针法指扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针：该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter,R)，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q）③TaqMan探针法指扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个85

与目标序列互补

当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号与目标序列互补当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器86Taqman技术原理reporterquencherTaqman技术原理reporterquencher87Taq酶在链延伸时遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）就会将切割探针释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数 PCR扩增过程中：Taq酶在链延伸时遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活88Probes:Taqman(doubledye)Probes:Taqman(doubledye)89化学试剂工作原理淬灭剂信号检测主要应用范围SYBRgreenI结合于双链DNA的小沟中无延伸定量和检测目标基因融解曲线分析Molecularbeacons发夹型杂交探针有复性SNP分析定量和检测目标基因Taqman水解型杂交探针有任何步骤SNP分析定量和检测目标基因三种不同探针的比较化学试剂工作原理淬灭剂信号检测主要应用范围SYBRgree90数字PCR是一种绝对定量的工具当前DNA定量有三种，光度法：基于DNA分子的吸光度来定量；实时荧光定量：基于Ct值，也就是可以检测到荧光值对应的循

环数定量；数字PCR：最新的定量技术，基于单分子PCR方法来采用计数

的方法对DNA进行定量II.数字PCR数字PCR是一种绝对定量的工具II.数字PCR91主要采用当前分析化学热门研究领域-微流控的方法，将大量的稀释后的DNA溶液分散至芯片的微反应器中，每个反应器的DNA模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个DNA模板的反应器就会亮，没有DNA模板的反应器就是暗的。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的DNA浓度原理主要采用当前分析化学热门研究领域-微流控的方法，将大量的稀释92数字PCR原理数字PCR原理93目的：扩增产生特异长度的单链DNA方法：采用不等量的一对引物，若干循环后，量少的一种先

消耗完，剩下另一引物参与以后的循环反应，产生大

量单链DNA。两种引物的最佳比例一般是0.01：0.5μM(50-100:1)，关键是限制性引物的绝对量用途：制备核酸序列测定的模板和杂交探针基因组DNA结构功能的研究

III.不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNAIII.不对称PCR94不同方式的PCR技术名称主要用途简并引物扩增法扩增未知基因片断巢式PCR提高pcr敏感性、特异性，分析突变多重PCR同时检测多个突变或病原反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变单一特异引物PCR扩增未知基因组DNA单侧引物PCR通过已知序列扩增未知cDNA原位PCR研究基因表达锚定PCR分析具备不同末端的序列不同方式的PCR技术名称主要用途简并引物扩增法扩增未知基因片95加热变性冷却粘合扩增连接酶融合冷却聚合酶+dNTP连接酶连接酶链反应点突变的研究、微生物病原体的检测及定向诱变、单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断、微生物种型鉴定，癌基因的点突变研究加热变性冷却粘合扩增连接酶融合冷却聚合酶+dNTP连接酶连接96

高浓度引物低浓度引物高浓度引物低浓度引物97是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。用限制酶消化基因组DNA，用连接酶将各片段连接成环状。用限制酶切割已知序列，根据已知序列设计3′端引物和5′端引物，扩增未知序列未知序列未知序列III.反向PCR(reversePCR)

已知序列是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DN98已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶99用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物IV.多重PCR用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物IV.多重PCR100利用同位素、荧光素等对PCR引物进行标记，用以直观地检测目的基因特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分病毒1病毒2病毒3病毒4V.LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素、荧光素等对PCR引物进行标记，用以直观地检测目的101标记引物PCR观察PCR产物标记引物PCR观察PCR产物102已知靶基因片段一侧的序列。以mRNA为模板经RT合成cDNA，末端转移酶在cDNA3′末端加上poly(dG)尾。Poly(dC)锚定引物与poly(dG)尾互补结合引导合成未知DNA序列VI.锚式PCR已知靶基因片段一侧的序列。以mRNA为模板经RT合成cDN103cDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CCcDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引104模板生物素化引物PCR扩增探针亲和固相介质检测探针信号VII.PCR固相分析法模板生物素化引物PCR扩增探针亲和固相介质检测探针信号VII1051990年，Haase等首创利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物可直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增可进行细胞内定位适用于检测病理切片中含量较少的靶序列VIII.原位PCR原位聚合酶链式反应（InSituPCR）1990年，Haase等首创VIII.原位PCR原位聚合酶106操作步骤：

1.细胞或组织的固定

2.PCR扩增细胞内目的片段

3.原位杂交检测扩增产物人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片操作步骤：人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片107逆转录酶DNA聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增逆转录PCR是用来扩增RNA的cDNA拷贝的方法。RT-PCR非常灵敏，被用于从小量的mRNA生成大量的cDNA文库等领域；RT-PCR也能用于鉴定转录序列的突变及多态性IX.逆转录PCR（RT-PCR）逆转录酶DNA聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增逆转录108以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增主要用于克隆cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等。逆转录生成cDNA方式：以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为引物以oligo(dT)为引物，mRNA3`末端polyA与之互补以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增109热启动主要是通过抑制PCR反应体系一种基本成分，延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。避免了起始循环较低温度下的非特异性扩增，提高了PCR反应的灵敏度及特异性11.HotstartPCR（热启动PCR）热启动主要是通过抑制PCR反应体系一种基本成分，延迟DNA合110通过在PCR的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm约5℃特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势12.TouchdownPCR（降落PCR）通过在PCR的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。12111判断PCR反应的有效性和正确性：对PCR产物进行电泳，观察扩增条带的有无扩增及扩增片段的大小对产物进行定量分析和序列分析：检测产物中的点突变：PCR-RFLPPCR-ASOPCR-SSCPPCR-DGGE融点曲线分析PCR产物测序

PCR产物检测判断PCR反应的有效性和正确性：112凝胶电泳分析技术主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。其中琼脂糖凝胶电泳因操作简单，较常用，一般采用浓度为1-2%的琼脂糖凝胶通过电泳分析技术可直接观察到有无扩增产物，及产物片段的大小，可用于扩增产物的定性分析凝胶电泳分析技术主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。113HCMVPCR产物电泳分析结果

594bp600bp2652bp800bp50bp350bpM123HCMVPCR产物电泳分析结果594bp600bp2652114②PCR-RFLP法

限制性内切酶Ras基因突变限制性内切酶Ras基因②PCR-RFLP法限制性内切酶Ras基因突变限制性115正常突变电泳正常突变电泳116③ASO探针法ACTGASO探针正常病人PCR-ASO检测基因点突变:主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段,然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交③ASO探针法ACTGASO探针正常病人PCR-ASO检测117探针杂交技术探针（probe)是通过一定手段标记的已知核酸序列。探针杂交技术的原理：在一定条件下扩增产物与其特异性同源探针可按碱基互补原则形成杂交链，通过对其中探针信号的检测来获得产物的信息探针杂交技术探针（probe)是通过一定手段标记的已知核酸序118Ⅰ膜上杂交技术通常采用尼龙膜或硝酸纤维素膜。将待测核酸片段通过凝胶电泳分离后转印到膜上或直接点样于膜上再与探针进行杂交，经漂洗，显色得到结果。（Southern印迹、Northern印迹、斑点杂交）可对产物进行定性分析，但对操作要求较高，曾经主要用于科研，衍生技术已经逐渐广泛用于临床膜上杂交技术检测结果Ⅰ膜上杂交技术膜上杂交技术检测结果119探针杂交NC膜探针正常人突变纯合子突变杂合子探针杂交NC膜探针正常人突变纯合子突变杂合子120

类似于ELISA技术中的双抗体夹心法。首先通过微孔板孔壁上包被的捕获探针来捕获PCR产物。然后再用带有标记的检测探针与产物另一区域杂交，经过漂洗显色即可判断结果可用酶标仪判读，用于半定量测定。但整个操作过程不是全封闭的，易造成扩增产物污染Ⅱ微孔板杂交技术Ⅱ微孔板杂交技术121是近些年发展起来的一项新技术，通常的RT-PCR技术多采用的该技术，其反应体系中除常规引物外，还引入了荧光基团标记的特异性探针，可与模板一对一结合。有荧光共振数量转移法；荧光动态定量系统优点：在全封闭条件下进行PCR定量，有效防止了扩增产物的污染。实时监测，荧光定量，结果直观，定量准确。结合了PCR技术与探针杂交技术的优点，特异性强，灵敏度高Ⅲ荧光探针杂交技术是近些年发展起来的一项新技术，通常的RT-PCR技术多采用的122等/恒温方式的扩增技术核酸序列扩增法（nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）转录介导的扩增（Transcription-mediatedamplification，TMA）环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）链置换扩增法（stranddisplacementamplifica