液相色谱实验报告

仪器分析实验报告实习名称：液相色谱分析实验学院：化学工程学院专业：化学工程与工艺班级：化工班姓名：学号指导教师：日期：一、实验目的1、了解液相色谱的构造、原理及操作技术；2、了解并熟悉液相色谱仪的流程及操作方法。二．实验原理液相色谱由泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。高效液相色谱分析的流程。由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。高效液相色谱的分离过程。同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。三．仪器及试剂仪器：液相色谱仪（大连依利特）、微量注射器试剂；乙腈和0.1%磷酸水溶液1:1混合液、样品（氨基布洛芬）操作流程或步骤1、准备(老师已备好)准备所需的流动相，用合适的滤膜过滤，超声脱气；根据待检样品的需要选择并安装好合适的色谱柱；配置样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的滤膜过滤；检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常；开机：接通电源，依次开启不间断电源、泵、检测器，和检测器自检后，打开打印机、电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。用样品液润洗注射器，润洗干净后，取20µL标准液，注入贮液器，观察电脑上峰的形成。用润洗液润洗注射器，润洗干净后，取20µL样品也，注入贮液器，观察电脑上峰的形成，一次方法测量多组。实验完成后，清理实验仪器，关闭相应仪器，最后关闭电源。2、参数设定（1）波长设定：在检测器显示初始屏幕时，按[func]键,用数字键输入波长值，按[enter]键确认。按[CE]键退出到初始屏幕，也可以选择LC-solution

软件方便地设定；(2)流速设定：在泵显示初始屏幕时，按[func]键,用数字键输入所需的流速（柱在线时流速一般不超过1mL/min），按[enter]键确认。按[CE]键退出，也可以选择LC-solution

软件设定；(3)流动相比例设定：在A泵显示初始屏幕时，按[func]键,用数字键输入流动相B的浓度百分数，按[enter]键确认。按[CE]键退出，也可在软件中设定。3、更换流动相并排气泡将A/B管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中，逆时针转动A/B泵的排液阀180o，打开排液阀，按A/B泵的[purge]键，pump指示灯亮，泵大约以9.9mL/min的流速冲洗，3min（可设定）后自动停止，将排液阀顺时针转到底，关闭排液阀，如管路中有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。4、平衡系统

按泵的[pump]键，亮pump指示灯。用检验方法规定的

流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相，

观测泵控制屏幕上的压力值，

压力波动应不超过1MPa。

观察基线变化。如果冲洗至基线漂移<0.01mV/min，噪声为<0.001mV时，可

认为系统已达到平衡系统，可以进样。进样：将样品用滤膜过滤，用10uL玻璃注射器将样品液体从进样阀进（注意，进样时，尽量不要让针头接触进样孔的壁），进好样后，进行测试，观察工作电脑桌面上液相曲线变化，测试完后停止进样，用电脑进行数据分析。5、关机实验完毕后，关闭仪器和电脑。五．实验参数见附页实验结论1.已知液相关数据的计算1）理论塔板数的计算如图取第3组、第8组得峰高的平均值峰面积平均值A=(1825.31+1758.64)/2=1791.975如图取第3组数据，保留时间：2）分离度的计算取数据第2组，第3组数据取第3组，第4组数据取：R=1.5作为相邻两峰完全分离的标准。即可得到如下结论：，可认为完全分离。，可认为完全分离。未知液相关数据的计算取第12组、16组、20组数据峰高平均值峰面积平均值A=(170.84+174.42+176.54)/3=173.93理论塔板数的计算同上代入第16组数据，如下2）分离度的计算取第15、16组数据：取数据第16、17组数据，可认为完全分离。，可认为完全分离。结论标准液峰分别是出现在2.97750min的第3个峰、出现在9.34500min的第8个峰；三次样品峰分别是出现在15.49583min的第12个峰、出现在20.46667min的第16个峰和出现在26.50883min的第20个峰。由于实验组分比较简单，只要在实验过程中，严格控制且定量进样，就能得出准确的实验结果。若采用归一化法或内标法，虽然能得到准确更高的实验结果，但由于实验操作及计算均较为复杂，实验及数据处理的时间长，效率相对不高，故实验中采用外标法作为定量的方法。最佳色谱条件的选择是本实验准确度的关键。进样针进样时确保进样针中没有残留气泡，另外，在进不同浓度或不同的物质前因先用甲醇溶液润洗干净，以免相互影响。注意事项流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质

。使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子，然

后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml左右。每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新