TSHRH 017-2019《化妆品防腐挑战试验》

ICSICS71.100.70C2682Y42化妆品防腐挑战试验AntimicrobialEffectivenessTestingofCosmetics准T/SHR04-01实施上海日用化学品行业协会发布面言面言 2 33.生物安全措施和防污染措施 3 6.试剂和材料 4 附录A培养基和试剂 7附录B常见中和剂参考表 9目次本标本标准按照GB/T1.1-2009给出啜则起草。木标准由上海11用化学品行业协会提出和归门。本标准起草单位：上海海关食品中心、上海家化联合股份有限公司、上海东晟源II化有限公司、上海大祥质量技术服务有限公司、上海轻匚业研充所有限公司、上海H用化学品行业协会。本标准主要起草人：刘夏、李晓虹、王传现、曹平、陈园园、陈III、谢坤、王革、李琼、陈逸君、金坚、陈亦华2刖—a刖—a—舌化妆品防腐挑战试验1范围本部分规定了化妆品防腐性能的检测评价方法化妆品防腐挑战试验1范围本部分规定了化妆品防腐性能的检测评价方法。木部分适用于液体类、乳液类、膏霜类等常见化妆品的防腐体系性能测试，其他产品也可根据用途选择采用。2规范性引用文件防止污染措施应符合GB/T27403的规定。4术语和定义4.1防腐挑战试验卜.列文件对F本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用』仅所注II期的:直用「本文件。凡是不注II期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用J•本文件。化妆品安全技术规范(2015版)消毒技术规范(2002版)GB/T6682-2008分析实软宰用水规格和试臆方法GB19489-2008实验宰圭物安全通用要求GB4789.28-2013食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求3生物安全措施和防污染措施3.1生物安全措施为了保护实验宰人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测，所有培养物和废弁物应参照GB19489中的有关规定执行°3.2防污染措施即微生物挑战性实验将一定虽的微生物加入到化妆品中，模拟化妆品中可能出现的污染情况，何隔一定时间对其中的活菌量进行检测，以活菌增减量判断化妆品防腐体系效能的实验方法，和剂(neutralizer)在微生物杀灭试验中，用以消除试验微生物与杀菌剂的混悬液中和微生物表面上残留的杀菌剂，使其失去对微生物抑制和杀灭作用的试剂。指中和剂与杀菌剂作用后的产物。5仪器和设备5.2移液器：量程OELlOpL：最程10glz^lOO|iL：最程100pI^1000四L及无菌吸头。5.3无菌吸管，10.0i«L(具0.1niL刻度)或移液器及吸头。5.5显微镜：5.6三角瓶(200mL)；5.9电子大平。5.10生物安全柜。35.5.11计时器。5.12比浊仪。5.13涡旋振荡器°6试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析务L或生化试剂。6.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。6.2磷酸盐缓冲液(PBS):0.03nnnol/L.pH8.0.见附录A.16.3营养琼脂培养基：见附录A.2。6.4沙氏琼脂培养基(SDA):见附录A.36.5EugonLT100肉汤：见附录A.4。6.6D/E中和肉汤(Dey/Eii§ky中和肉汤)：见附录A.5一6.7改足Lethecn肉汤：见附录A.66.8胰蛋白腺大豆琼脂(TSA):见附录A.7,6.9试脸菌株：金黄色葡篇球菌(ATCC6538)、大肠埃希氏菌(ATCC25922)、铜绿假单胞菌(ATCC15442)、白色假统酵母菌(ATCC10231)、黑曲霉菌(ATCC16404)。7操作步骤7.1菌液制备7.1.1白色假丝酵母菌菌液的制备：从保存好的试管斜面上(或商种保存管中)取适量的菌体或菌种吸附小磁珠接种于沙氏葡葡糖琼脂斜面，28UC±2°C,培养18-24h.用接种环取第1代培养物，划线接种JSDA平板,28C±2C,培养18-24ho挑取上述第2代培养物中典型菌落，划线接种JSDA琼脂斜面,28C±2C,培#18-24h,即为第3代培养物■吸取适量的无菌IBS缓冲液加入斜血试管内，反复吹洗，洗下菌苔。将洗液转移至另一无菌试管中,涡旋混匀20&用PBS缓冲液将其稀释成约1.0X106cfti/niL^1.0X107cfiiAiiL的菌悬液。制备好的菌悬液应在2h内使用，或在：2°C~8°C保存不超过24h；7.1.2铜绿假单胞南'金黄色葡荷球菌\大肠杆南南液的制备：从保存好的试管斜面上(或菌种保存管中).1代培养物，划线接种JTSA平板，36C-1C°C,培»18-24ho挑取上述第2代培养物中典型菌落，划线接种于ISA琼脂斜面，36C士1CC,培养18-24h,即为第3代培养物。吸取适量的无菌生理盐水加入斜面试管内，反复吹洗，洗下菌苔。将洗液转移至另一无菌试管中，涡旋混匀20s。用无窗生理盐水将其稀桦成约1.0X107cfivm~1.0X108chi/mLL的菌悬液＜=制备好的I莉悬液应在2h内使用，或在2C8C保存不超过24h°7.1.3黑曲卜抱子悬液的制备：从保存好的试管斜面上(或菌种保有取适量的菌体或菌种吸附小关接种于马铃薯葡苟糖琼脂斜面，22.5C±2.5°C,培养7d-lld吸取适量的无菌0.05*/可吐温80生理盐水加入斜面试管内，刮洗黑曲客分生弛子于溶液中。将抱子悬液转移至装有玻璃珠的无菌上角瓶中，轻轻振摇Inin后,用无菌玻璃棉过滤除去菌丝。过滤后,显微镜下(400倍)观察悬液中是否存在菌统，若悬液中有菌统存在，可经2000g,离心20n血除去菌税。再次在显微镜下观察，若仍仃闻#存在:，冶rjjq心闰0.05%(v/v)吐温80生理盐水将其桶祥成1.0x106cfti/niL-l.OX107cfiiAnL的泡子悬液。制备好的山子悬液应当天使用;或在23C保存不超过2d,使用前混合均匀并在显微镜下观察是否有饱子出芽，若有抱子出芽，则弃之不用。7.2中和剂鉴定试验7.2.1每种试验菌株的中和剂鉴定试验应分别进行.7.2.2化学中和剂的选择：为了中和化妆品中的防腐剂，多采用D成中和肉汤、EugonLT100液体培养基或者改度LETHEEN肉汤-若中和效果不理想，可根据产品中添加的防腐剂类型，参考附录B进行选择。7.2.3化学中和剂鉴定流程7.2.3.1将7.1中准备的菌液10倍系列稀释至浓度为IX10scfu/mL的菌悬液，用F中和鉴定试验。477.2.3.2将1g或1mL样品加入到9mL中和剂中，彻底混匀，室温作用30±15min,制成中和产物：若中和效果不理想,可用中和剂作为稀释液进行二次倍比稀祥。将1mL秘忏液(PBS)加入到9mL中和剂中，彻底混匀,室温作用30±15min,作为对照组。7.2.3.3分别接种1mL7.23.1中制备的陶夜至测试管(含10mL中和产物)和对照管中，涡旋混匀。同时接种1mL7.23.1中制备的菌液至10mL稀释液(PBS)中，作为阳性对照组。7.2.3.1分别对测试组、对照组和阳性对照组进行平板计数,/个稀秆度进行双平行实隐细菌培养基7.2.3.5对各组进行汁数，测试组计数结果记作Nvf,对照组计数结果记作Nvn,阳性对照组计数结果记作Nv：q1Nvn接近Nv,并且NvfNO.5Nvn时，认为中和剂有效。7.2.1其余中和方法:除化学中和剂方法外，还可采用稀释法、过滤冲洗法对产品中残留的防腐剂进行偿活菌回收率灵敏度的降低，以避免假阴性结果(例如，可采用膜过滤il数法代替稀祥液平板计数法)。7.3挑战试验7.3.1符种试软菌株的杀菌试矣应分别进行。7.3.2挑战试验而应该先按照《化妆品安全技术规范》(2015版)第五章第2节“菌落总数检验方法”对样品进行“菌落总数”检测。7.3.3接种：取0.2mL7.1中制备的菌液,加入到装有20g或20ml样品的无菌塑料瓶中,彻底混合均匀。接种后的样品置于22.5°C±2.5C培养，寡别在7,14,28天计数,分别计作Nx(X=7,M,28)。7.3.4计数：培祥至:特定时间后(「，14,21,28天)，取1mL或1g接种后的样品，加入含有9mL无商中和剂的试管中,充分涡旋混匀。(若中和剂鉴定试验中，对样品进行百倍稀4iter中和剂的什段性,则接种后的样品进行计数时也应进行百倍稀科.与中和剂作用30±15min后，分别吸取1.0mL样液于2个无菌至皿中连行平板计数。如平板上生长菌落数较多,可进行10倍系列稀释,选择合适的稀移度进行平板计数。何个稀祥度至少进行双平行汁数。黑曲客菌在22.5°C±2.5°C培养3-5d：铜绿假单胞卸金黄色葡篇球菌'大肠杆菌和白色假幼.酵件菌在32.5C±2.5C培养48-72he7.3.5选取菌落数在30-300efu(细菌和白色假税酵母菌)或者15-150efu(黑曲客)的平板进行汁数，并按照Nx=C/(Vd)计算样品中的活菌浓度(C代表计数平板E的菌落平均数：V代表衬II上的加菌样品接种量，一•般为1mL：d代表计数平板对应的稀释倍数]7.3.5除大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡荷球菌、白色念珠菌、黑曲霉外，还可根据产品具体情况，增加特定的试与佥菌，该试驳蔺可以代表产品最可能受到的生物污染；比如，在高糖分门服制剂(口腔用品)的防腐挑战试骚中，推荐增加鲁氏接合酵母NCYC381,8结果判断参考表1对产品进行防腐效果评价。5价标准减少值Rx(Rx=lgN0-lgNx)a6菌种菌种细菌白色假丝酵母菌测试时间T7T14T28T7T14T28标准A>3>3且>3且>1>1且>1且NIbNIbNIbNIb标准B/>3>3且/NIb>1>1且NIbb：NI表示Nx与前一•测试时间点相比未增长。c：当1gN0=lgNx,且Nx与初始浓度No相比未增长时，Rx=OoT14>OCT28>1且NIb>0且NIb制法：除制法：除琼脂外其他成分溶解「蒸饷水中，调pH至7.2~7.4,然后加入琼脂，加热溶解，分装；12FC高压蒸汽灭菌15min后备用。A.3沙氏琼脂培养基(SDA)制法：JIJ「00ml蒸饲水将琼脂溶解，300m水将葡荷糖与茉白豚溶解，混合卜.述两部分，调pH至5.6±0.2,摇匀后分装，115C压力蒸汽灭菌15min：使用前，用过滤除菌方法加入0.1g/L的氯霹素或者0.03g/L的链霉素。A.4.1制备大豆粉木瓜醉消化物5.0gL0.7g氯化钠4.0g5.0g1.0g1000.Ont制法：将上还各成分，吐温80,辛苯聚醇一9以及卵磷脂依次加入到沸水中煮沸至完全溶解。待溶液冷却后，调节pH至二。士0.2,将培养基分装至合适容器中，「121°C高压灭商15minA.10.03mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)A.1.1制备称取无水磷酸氢•.钠2.83g.磷酸.氢钾1.36g,加蒸饲水1000mL,待完全溶解后，调pH至7.2〜7.4121C高压蒸汽灭菌15niinA.2营养琼脂培养基附录A(规范性附录)培养基和试剂7A备A备蛋白豚牛肉育氯化钠琼脂蒸饷水15.0g-20.0g1000mLA.3.1制备蛋白豚葡荷糖琼脂蒸饷水1000mLA.5DZE中和肉汤(A.5DZE中和肉汤(Dcy/Englcy中和肉汤)7.0g硫代硫酸钠6.0g吐温80酪蛋白胰酶消化物亚硫酸氢钠2.5g酵母抽提物2.5g硫代乙酸钠0.02g蒸ta水制法：将上述各成分或脱水完全培养基依次加入水中加热至完全溶解，待溶液冷却后.调节pH令7.0±0.2,将培养基分装至合适容器中,J121C高压灭菌15min。A.5.1制备制法：将吐温80以及卵磷脂依次加入到沸水中煮沸至完全溶解，加热时混合其他成分溶解，轻轻混匀，避免泡沫。待溶液冷却后，调节pH至7.2土0.2,将培养基分装至合适容器中，F121C高压灭南15min3A.7胰酪豚大豆琼脂培养基(TSA)A.7.1制备制法：除琼脂外其他成「蒸⑶水中，调pH-^7.2-7.1,加入琼脂，加热溶解，分装：12VC灭菌15min后备用。8A.6A.6.1制备肉类胃蛋白酶消化物酪蛋白胰酶消化物吐温80氯化钠亚硫酸狙钠蒸饷水20.0g5.0g5.0g2.0g0.7g5.0g5.0g酪蛋白胰醵消化物大豆粉木瓜恤消化物氯化钠情水5.0g5.0g甲酸生成削甲酸生成削的酸，lg/L此况.90,30富L+皇素，30g/L+L.ffl筋敢，lg/L+L•拳购教，1&LD/E中和肉汤JSDCLP液体培养是h.洗涤削：吐温.80,3岁L+L•组筮酸，05g/L领化荆球硫物中和礼硫代硫龄1，5g/L洗涤削：硫代硫酸虬