鱼类细胞肥大虹彩病毒病的流行与防治

鱼类细胞肥大虹彩病毒病的流行与防治

虹色病毒主要感染无脊椎动物和低脊椎动物，属于20个体状结构和转化后的dna病毒。虹彩病毒科(Iridoviridae)共分为5个病毒属,即虹彩病毒属(Iridovirus)、绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)、淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)、蛙病毒属(Ranavirus)和细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)。其中,细胞肿大病毒属虹彩病毒是鱼类重要病毒性病原之一。近年来在东亚、东南亚和欧洲地区,由该类病毒引起的鱼类疾病已呈明显上升趋势,患病鱼的死亡率从30%(成鱼阶段)到100%(幼苗阶段)不等,给水产养殖业造成重大的经济损失,严重阻碍了鱼类养殖业的健康发展,在国内外受到愈来愈大的关注。为了对鱼类细胞肿大虹彩病毒病进行深入的了解,并为该类疾病的研究与防控提供参考,本文将已见报道的由细胞肿大虹彩病毒引起的鱼类虹彩病毒病的流行病学、临床症状、病理学和病毒的检测技术、传播途径、致病机制、免疫防治等方面的研究进展综述如下。1病毒属石斑鱼类型病毒,与nsiv、鱼病毒和理化聚合酶系统发育迄今为止,文献报道的鱼类细胞肿大病毒属虹彩病毒已有20余种,该属虹彩病毒感染的硬骨鱼类包括鲈形目、鲽形目、鳕形目和鲀形目等4目近百种海水、淡水鱼类。1992年,InouyeK等在患病真鲷(Pagrusmajor)的组织切片中观察到坏死组织中存在可被姬姆萨染色的异常肥大细胞,并在肥大细胞中发现了真鲷虹彩病毒(Redseabreamiridovirus,RSIV)。这是第一个被发现的细胞肿大病毒属虹彩病毒。NakajimaK等从患病鲈鱼(Lateolabraxsp)、日本条石鲷(Oplegnathusfasciatus)体内各分离出一种虹彩病毒,并将它们分别命名为海鲈虹彩病毒(Seabassiridovirus,SBIV)和日本条石鲷虹彩病毒(Japaneseparrotfishiridovirus,JPIV)。JungSJ等报道韩国南部海域网箱养殖的条石鲷暴发了一株虹彩病毒病,患病鱼死亡率高达60%。DoJW等测定了该病毒的基因组序列,发现该病毒ATP酶(adenosinetriphosphatease,ATPase)和DNA聚合酶(DNApolymerase,DPOL)的基因序列与RSIV的同源性分别高达99%和97%,并将其命名为条石鲷虹彩病毒(Rockbreamiridovirus,RBIV)。2005年,DoJW等从韩国沿海5个地域的患病牙鲆(Paralichthysolivaceus)体内分离出13株虹彩病毒,通过对病毒的主要衣壳蛋白(majorcapsidprotein,MCP)基因及氨基酸序列分析,发现这些病毒株与RBIV、RSIV、ISKNV等病毒的同源性较高。DanayanolY等报道了由一种虹彩病毒引起的泰国养殖点带石斑鱼(Epinephelusmalabaricus)昏睡病,SudthongkongC等依据病鱼病征将该病毒命名为石斑鱼昏睡病虹彩病毒(Groupersleepingdiseaseiridovirus,GSDIV)。在我国,多种细胞肿大病毒属虹彩病毒陆续被发现,其宿主几乎涵盖了我国主要的海水养殖鱼类以及重要的淡水养殖鱼类。1992年在台湾澎湖养殖的石斑鱼(Epinephelussp)、真鲷等暴发了一种虹彩病毒病,该病毒可导致养殖石斑鱼、真鲷等大量死亡,死亡率高达60%~100%。ChouHY等通过回归感染试验证明了病毒的致病性,并依据病毒形态特征将其命名为台湾石斑鱼虹彩病毒(Taiwangrouperiridovirus,TGIV)。1994年广东省养殖鳜鱼(Sinipercachuatsi)暴发性流行病是由虹彩病毒引起,在病鱼脾脏组织中观察到截面呈六角型、直径约150nm的球状病毒。由于该病毒主要感染鳜鱼的脾脏和肾脏,HeJG等建议将该病毒命名为传染性脾肾坏死病毒(Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)。WengSP等报道了广东网箱养殖的石首鱼(Sciaenopsocellata)患有病毒性传染病,通过对病鱼的临床症状、病理及病毒的核酸序列分析后将其鉴定为虹彩病毒。2003年ChenXH等从福建沿海养殖场患病大黄鱼(Larimichthyscrocea)体内分离到一种病毒,通过组织病理和病毒形态学分析,鉴定为大黄鱼虹彩病毒(Largeyellowcroakeriridovirus,LYCIV)。ShiCY等在山东半岛患病大菱鲆的病变细胞内观察到一种20面体状病毒颗粒,并根据病毒的形状、大小、在细胞内的位置、靶组织类型以及病毒的MCP和ATP酶基因序列同源比对分析等将其鉴定为虹彩病毒,命名为大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbotreddishbodyiridovirus,TRBIV)。此外,在其他养殖鱼类如鲻鱼、罗非鱼、鳕鱼以及观赏鱼类神仙鱼、非洲灯眼鳉和小密鲈等患病鱼体内陆续发现了不同种类的细胞肿大病毒属虹彩病毒。总的来说,细胞肿大虹彩病毒在东亚和东南亚发现最早、种类最多、流行最为广泛、感染的鱼类品种也最多,而在美洲、欧洲等地区则较为少见。2组织病理学检测感染细胞肿大病毒属虹彩病毒的病鱼,其外观临床症状一般包括:体表无明显损伤,嗜睡,游泳异常;贫血症状明显,血液稀薄、色淡,凝固性差,鳃外观呈暗灰色;肾脏失血,呈灰白色等。但病鱼的临床症状也存在一定的差异,如ShiCY等报道,感染TRBIV的大菱鲆病鱼腹面沿脊椎骨附近皮下淤血、发红,侧鳍、尾鳍、胸鳍及鳍基部充血、发红。而KimWS等则发现,感染TBIV(Turbotiridovirus)的大菱鲆呈现体色苍白、腹部膨胀、眼睛突出等临床症状。在组织病理学变化方面,细胞肿大虹彩病毒通常会导致病鱼的脾、肾等病毒靶器官内出现大量嗜碱性的、细胞质匀质化的、直径约15μm~20μm的肿大细胞,这是该类病毒重要的感染特征之一,也是该类病毒被命名为“细胞肿大虹彩病毒”的原因。这些肿大细胞内含嗜碱性的包涵体和固缩的细胞核。ShiCY等发现患病大菱鲆的鳃组织结构松散,次级鳃丝变厚或相互融合,上皮细胞层肿胀、崩解、脱落,柱细胞断裂、解体;黏液细胞和盐细胞萎缩,结构不清;次级鳃丝的毛细血管中密实充斥着大量血细胞。病鱼脾组织解体,椭圆体鞘崩解,细胞离散,其中分散着大量红细胞和淋巴细胞;肾脏造血组织肥大细胞内线粒体肿胀,内嵴结构消失。而KimWS等发现感染TBIV的大菱鲆心内膜以及肝脏窦状隙、实质细胞内均出现炎症细胞;鱼眼脉络膜内也出现肿大细胞,并出现坏死灶,肿大细胞的细胞核肿胀、崩解或结构不清。JungSJ等发现患病石鲷的胃、肠等器官的固有层、黏膜下层、浆膜层出现坏死的上皮细胞。以上这些临床症状和病理变化表明,细胞肿大虹彩病毒病是一种全身性、系统性感染,病毒对鱼体上皮组织和内皮组织亲嗜性较强,对脾脏、肾脏等鱼类造血器官和组织的破坏尤为严重,从而导致病鱼贫血、多器官衰竭而死亡。3多重pcr技术的应用由于PCR技术具有特异性强、对感染早期诊断有效,而且检测速度快、灵敏度高等优点,目前已成为检测虹彩病毒的主要技术手段。依据虹彩病毒的MCP、DPOL、DNA转甲基酶、ATP酶、核糖核酸酶还原酶(RNRs)基因以及其他ORFs或限制性酶切核酸片断序列,已建立相应的PCR检测技术,并成功进行了鱼类细胞肿大虹彩病毒的检测。在此基础上还建立了其他方法,如JeongJB等利用RSIV的RNRs、ATPase、DPOL基因的保守序列以及PstⅠ酶切核酸片断,建立了多重PCR技术应用于鉴别RSIV的不同地理株上。ChaoCB等在利用RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA,随机扩增的多态性DNA)扩增TGIV的核酸序列基础上建立了TGIV的套式PCR检测技术,该技术的灵敏度达到50fg的病毒核酸。邓敏等利用ISKNV的RNRs基因保守序列的PCR产物作探针,经地高辛标记,成功地在病鳜的脾肾组织中进行了病毒的原位杂交检测,试验结果与HE染色、电镜观察以及PCR检测结果一致。而ChaoCB等利用地高辛标记TGIVATP酶基因保守序列的PCR产物合成长为1208bp的核酸探针,建立了TGIV的原位杂交检测技术,还将该技术应用到TGIV在病鱼体内感染高峰期的检测以及病毒精细结构的研究。CaipangCM等依据RSIV基因组的PstⅠ酶切核酸片断建立了RSIV的环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)检测技术,甚至3pg的病毒核酸亦可以被检出,比常规PCR技术的灵敏度高10倍以上。而WangXW等根据LYCIVATP酶基因设计了一种特异性分子信标(单链荧光核酸探针),并在此基础上建立了LYCIV的荧光实时定量PCR检测技术,其灵敏度可达到70个病毒基因组,而且该技术还能对病鱼组织进行病毒的定量检测。4垂直传播途径的研究研究表明,虹彩病毒可通过垂直和水平两种途径在仔稚鱼、幼鱼和成鱼间进行传播。研究者在病鱼脾肾等器官中发现大量病毒粒子,这说明病毒的感染具有组织特异性,使得病毒能够在其靶器官中大量复制;另外,由于脾脏、肾脏是鱼类的造血器官,病毒能很快地随着血液循环,扩散到性腺进行垂直传播。ChoiSK等在无临床症状条石鲷的白细胞中检测到RSIV的存在,这表明细胞肿大虹彩病毒有随血液循环扩散到性腺进行垂直传播的可能。而从病鱼生殖腺提取的病毒悬液具有感染性的试验也说明病毒垂直传播的存在。吴淑勤等采用PCR技术在表型健康的鳜亲鱼的精巢和卵巢中均检测到ISKNV的存在,而在表型健康子代内脏中的检测结果亦呈现阳性,以上结果表明病毒能以潜伏的形式存在于病鱼体内进行垂直传播,而病毒的流行病学调查也证明垂直传播途径客观存在。越来越多的研究发现,虹彩病毒主要是通过水平途径在水体、饵料和鱼体间进行传播和感染。曾慷等通过ISKNV的人工感染试验发现体表划痕、腹腔注射、浸泡和口服等途径均能引起鳜鱼患典型病症,结果证明病毒存在以食物链、体表感染等方式进行水平传播。而病毒的分子生物学分析结果证实,不同地区间的水产贸易进一步促进病毒发生跨地域、跨物种间的传播。此外,在ISKNV的人工感染试验中发现,养殖水温为20℃时感染鱼无死亡,随水温的上升,感染鱼的死亡率增加。而ChoiSK等利用相同的试验证明,RSIV在水温低于18℃时以潜伏的形式存于条石鲷体内,水温上调的过程中病鱼的累积死亡率增加。由此可以看出,虹彩病毒的传播与感染存在温度依赖性。5caspase-3和tnf受体样在不同形态变化特征下发生的作用鱼类虹彩病毒主要是通过以下两种方式对感染细胞造成损伤:①诱导宿主细胞凋亡;②从宿主细胞中出芽释放或直接裂解宿主细胞。研究表明,虹彩病毒能诱导其敏感细胞系发生凋亡,从而对感染细胞造成损伤。ImajohM等根据RSIV诱导的GF细胞在凋亡中后期的形态变化特征,验证了caspase-3和caspase-6在凋亡中发生作用。目前已在多株虹彩病毒的核酸序列中鉴定出TNF受体(TumornecrosisfactorReceptor)样同源序列,而TNF受体样同源序列可能在虹彩病毒诱发的级联凋亡中发生作用。病毒通过出芽释放破损细胞膜进而损伤宿主细胞是虹彩病毒主要的致病机制之一。病毒的核酸-蛋白质复合体首先进入部分形成的核衣壳中,然后核衣壳封闭形成完整的病毒粒子,进而借助自身的膜趋向性蛋白与宿主细胞质膜或其他内膜相互作用进入细胞。如ISKNV通过细胞器(如内质网或高尔基体)芽殖的方式形成包膜,进而在通过出芽方式释放完整病毒粒子的同时导致细胞裂解,细胞膜破裂,并最终使病毒靶器官受到破坏,失去正常的免疫功能,以致病毒通过循环系统扩散到全身器官组织,从而导致宿主死亡。6rsiv的免疫疫苗是防控鱼类病毒病的重要手段,在细胞肿大虹彩病毒的灭活疫苗、核酸疫苗以及基因工程疫苗等方面已有较多的研究报道。NakajimaK等报道了利用甲醛灭活的RSIV疫苗对5种海水鱼类进行免疫接种,对照组死亡率为73%~100%,免疫组的成活率为55%~100%。目前在日本,应用于RSIV的灭活疫苗已经商业化。CaipangCM等利用RSIVMCP基因和一个编码跨膜蛋白的ORF构建了RSIV的2个核酸疫苗表达质粒pCMV-MCP和pCMV-569,并用它们对真鲷幼鱼进行免疫接种试验。在以接种空载体和PBS对照组的免疫保护率为0的条件下,接种pCMV-MCP、pCMV-569及其二者联合免疫试验组的免疫保护率分别为42.8%、71.4%和71.4%,再次免疫试验组的免疫保护率分别为68.7%、67.7%和67.7%,免疫组真鲷的MHCI、MHCⅡ和IgL在接种疫苗约1周后分别得到较高的表达,说明RSIV的核酸疫苗具有良好的免疫效果和较高的保护率。何建国等在鉴定出ISKNV的2个膜蛋白、4个环指蛋白具有泛素连接酶活性的基础上,确定了2个基因工程疫苗,中和试验表明这2个基因工程