核酸大实验(上课)

核酸大实验----生化三组实验一.动物肝细胞内DNA和RNA的提取和分离实验二. 地衣酚法测定RNA含量实验三.二苯胺法测量肝组织中DNA的含量实验一.动物肝细胞内DNA和RNA的提取和分离实验目的：初步掌握从组织中分离和提纯DNA与RNA的原理和方法。实验原理：核酸的常用方法是STS法：首先使细胞破碎，使核酸处于易提取的状态。其次除去组织中存在的酸溶性物质，脂类及蛋白质等物质，因为它们可干扰

RNA和DNA的测定。然后根据碱水解RNA而不水解DNA的特性，可将RNA水解产物与DNA分开，再分别测定

RNA和DNA的含量。仪器：研钵、剪刀、各式试管、离心管；离心机、三用恒温水浴箱，手术器械。试剂：柠檬酸钠、20%三氯醋酸（TCA）、10%TCA、无水乙醇、氯仿-甲醇（体积比2：1）混合液、乙醚、0.3N氢氧化钾、6N盐酸、0.1N盐酸、5%高氯酸溶液仪器与试剂：具体操作流程：制备鸡肝匀浆去酸溶性杂质除去脂质称取0.8g鸡肝，加入柠檬酸钠研磨成浆加入20%TCA，搅匀离心加入10%TCA搅匀离心加1mL蒸馏水+7mL无水乙醇，搅匀离心，重复；加氯仿甲醇混合液，搅匀离心，重复；加乙醚，搅匀离心，重复；37℃水浴15min蒸干乙醚抗凝血剂可提高RNA提取量使蛋白质变性沉淀蛋白质除去残余的TCA与柠檬酸钠均为脂质的良好溶剂研磨好的鸡肝匀浆加入氯仿甲醇后沉淀在清液上方加入氯仿甲醇后沉淀在清液下方分离RNA分离DNA倒出上步所得粉末，加KOH研磨成

糊状，加入试管中37℃水浴1h；加1.3mL6N盐酸，沉淀完全，离心；收集上清液；加6.7mL0.1N盐酸，搅匀离心，收集合并上清液；去RNA部分沉淀中加5%高氯酸

6.5mL；95℃水浴15分钟；水浴后直接离心，取上清液；上清液用5%高氯酸定容至8mL；蒸干乙醚后所得粉末加入KOH后研磨成糊状操作注意事项：研磨鸡肝时先加1mL柠檬酸钠，基本成浆后再加3mL柠檬酸钠比直接加4mL柠檬酸钠更利于研磨。除脂质时应先加1mL蒸馏水并立即搅匀，加入无水乙醇后再搅拌，固体容会结成块状，难以搅开。加入氯仿甲醇后的沉淀与清液不易分离，可以用 一张滤纸挡在离心管口，让清液顺滤纸流下，从而达到分离的目的。离心机使用时务必保持平衡，否则会引起各种事故与机器的损坏。实验二. 地衣酚法测定RNA含量实验目的：掌握用地衣酚法测定RNA含量的原理和方法。实验原理：核酸在碱性条件下水解为碱基、五碳糖和磷酸，这三个组分在核酸分子中等比例存在，故测定其中任一组分均可计算出核酸的量。酸性条件下RNA中的核糖脱水环化成糠醛，地衣酚(3，5二羟基酚)可与其作用呈绿色，在670nm处有最大吸收，用分光光度计测得反应液OD值从而可知样品中RNA的含量。仪器与试剂：仪器：试管、分光光度计、比色皿、水浴锅试剂：RNA待测液、RNA标准液、6N盐酸、地衣酚具体操作：按教案上表格依次加样；混匀各管，沸水浴15分钟待上述各管冷却后，以空白调零点，670nm比色，读取光密度（O.D）值按公式计算每克肝组 织中RNA含量：RNA（mg/g组织）=O.D待测/O.D标准×0.1×1/0.05×5=O.D待测/O.D标准×10加入地衣酚，准备进行水浴加热水浴加热后，含RNA的管中出现绿色注意事项：沸水浴15分钟的时间掌握一定要准确。试管从水浴中取出后应尽早测量OD值， 放置时间过长会导致OD值的改变。可用冷水冷却试管，但不要用冰水 冷却，过冷会导致OD值的改变。实验三.二苯胺法测量肝组织中DNA的含量实验目的：掌握用二苯胺法测定DNA含量的原理和方法实验原理：核酸在碱性条件下水解为碱基、五碳糖和磷酸，这三个组分在核酸分子中等比例存在，故测定其中任一组分均可计算出核酸的量。DNA中的脱氧核糖在酸性条件下脱水生成w-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺反应生成蓝色物质，在595nm有最大吸收峰。仪器与试剂：仪器：各种试管，分光光度计、比色皿、水浴锅试剂：DNA待测液、DNA标准液蒸馏水、20%高氯酸、二苯胺具体操作：按教案上的表格依次加样；混匀各管，80℃

水浴35分钟待上述各管冷却后，以空白调零点，595nm比色，读取光密度（O.D）值按公式计算每克肝组织中DNA含量：DNA（μg/g组织）=O.D待测/O.D标准×200×5=O.D待测/O.D标准×1000水浴加热后的DNA反应液，呈蓝色从左至右依次是：标准管、待测管、空白管加样时一定要按表格上的顺序先加高氯酸再加二苯胺，不然会出现白色沉淀，影响后续