实验2底物浓度对酶活力的影响(碱性磷酸酶米氏常数的测定)-lv-中医

实验2底物浓度对酶活力的影响—米氏常数的测定一、目的要求1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定的原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基酚磷酸为底物时的Km

和Vm值。光的互补示意图物质的颜色和波长：可见光：波长（λ）400—760nm紫外光：λ小于400nm红外光：λ大于760nm溶液的颜色和光吸收的关系：溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。二、分光光度法（比色分析法）原理和方法（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析1.比较吸收光谱曲线维生素B12溶液的吸收光谱2.比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为280nm；核酸的最大吸收波长为260nm。3.比较吸光度的比值纯DNA：（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析1．原理

Beer-Lambert（比尔）定律：物质的吸光度与吸收物质的浓度和液层的厚度成正比。当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（A）与溶液的浓度（C），液层的厚（L）以及入射光的强度（I0）有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收定律。T=I/I0=10-εclA=lg1/T=lgI0/IA=εcl

其中：T为透光率，A为吸光率，I0为入射光强度，I为透射光强度，ε为摩尔消光系数，C为溶液浓度，L为溶液光程的厚度，A为光吸收值

2．常用方法（1）标准曲线法

标准曲线与样品的测定条件必须一致。（2）标准管法CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX可求得CX。 （3）摩尔吸光系数法C=A/L（

为L=1cm，C为1mol/L时的吸光系数，

也称为摩尔吸光系数)。三、米氏常数的测定原理酶促反应v-[S]曲线

v

[S]其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km

为米氏常数

米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。

测定Km和Vm，可通过作图法求得。最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：以1/v对1/[S]作图，可得一条直线1/v1/Vm

-1/Km1/[S]本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基酚磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm.反应式：pNPP+H2OpNP+HPO42-

无色黄色

可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。

四、试剂与器材试剂：0.5

mol/mLpNP、10mmol/LpNPP、20mmol/LMgCl2、0.1mol/L碳酸钠—碳酸氢钠pH10.1缓冲液、0.1mol/LNaOH、6mg/mL碱性磷酸酶酶液器材：恒温水浴锅、分光光度计五、操作方法（一）对硝基苯酚标准曲线的制作取13支试管编号,0号一支,1－6号各二支,按下表操作：

管号01,1’2,2’3,3’4,4’5,5’6.6’

pNP含量(

mol)00.050.100.150.200.250.300.5

mol/mLpNP(mL)00.10.20.30.40.50.6H2O(mL)0.80.70.60.50.40.30.2Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mL0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mLA405以对硝基苯酚的绝对量(

mol数)为横坐标，A405值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数(

)值。（二）测定（按下表操作）

取15支试管，1－5做两组平行测定管，01－05作为空白对照。No.1,1’,012,2’,023,3’,034,4’,045,5’,05

底物终浓度[S](mM)0.50.751.01.5310mmol/LpNPP（mL）0.10.150.20.30.6蒸馏水（mL）0.600.550.500.400.10碳酸盐缓冲液（mL）各加1.0mL20mmol/LMgCl2（mL）各加0.2mL预热混匀，37℃，5分钟酶液（mL）测定管各加0.10mL酶液（空白管不加）反应时间37℃，精确反应10分钟0.1mol/LNaOH（mL）各加2mL酶液（mL）空白管(01－05)各补加0.10mL酶液A405（三）数据处理各管在分光光度计测定波长405nm的A值(A405)。从对硝基苯酚标准曲线上查出A405相当于产物对硝基苯酚的含量(

mol数),计算出各种底物浓度下的初速度vo（单位以

mol

L-1

min-1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度Vm。实验数据处理表1“底物浓度对酶活力的影响”实验数据样品12345底物浓度[S](mM)A405pNP含量（

mol）V0(

mol

L-1

min-1）1/V1/[S]样品12345底物浓度[S](mM)A4051/A4051/[S]六、注意事项取液量一定要准确。反应时间一定要精确。加酶前后一定要将试剂混匀。空白对照一定要先加NaOH，后加酶。测定A405时要以各自的空白调零点。移液管或取液器的使用比色杯的使用分光光度计样池数：3管号11'22'33'44'55'加酶时间（min）0.5m1m1.5m2m2.5m3m3.5m4m4.5m5m加NaOH时间10.51111.51212.51313.51414.515反应时间（min）10101010101010101010七、思考题

(1)试说明的米氏常数Km的物理意义和生物学意义。(2)为什么说的米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是？八、分光光度计的使用比色杯的使用T6新世纪紫外可见光分光光度计的使用

UnicoUV-2000分光光度计的使用仪器操作键介绍“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式——透射比（T）、吸光度（A）、已知样品浓度值（C）、已知标准样品斜率（F）“100%”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%”键：用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮：用于设置分析波长3.样品测试操作①打开电源开关，使仪器预热20分钟②用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上③按“方式