炎症性肠病研究进展

炎症性肠病研究进展

炎症性肠病（ibd）是一种复发的肠道慢性炎症疾病，主要包括溃疡性胃炎（iu）和克罗恩病（cd）。关于其精确的病因和发病机制，尚不清楚，也缺乏有效的临床治疗方法。因此,建立理想的动物模型对于研究其病因和发病机制、疾病发展规律、确定诊疗手段及新药的研发均有重要意义。国外从20世纪30年代就开始制作模拟人类UC的动物模型,虽然与人类IBD相似且重复性好的理想动物模型目前尚少,但这些动物模型的研究为进一步深入探索人类IBD提供了有利条件。1动物模型目前IBD动物模型可分为4类:(1)化学物质诱导型动物模型;(2)基因工程型动物模型;(3)细胞移植型动物模型;(4)自发性动物模型。1.1化学诱导动物模型1.1.1uc动物模型(aceticacid):乙酸是具有弱酸性的有机酸,能直接破坏结肠上皮,继而肠内细菌和毒素侵入肠壁,引起后续的急性炎症反应。70年代有学者开始利用乙酸制作UC的动物模型,使用的动物主要是大鼠。方法有两种,一种是开腹经结肠腔灌注,一种是经肛门结肠腔灌注。目前后者较为常用,模型制作成功的关键是乙酸的浓度和作用时间,它直接影响病变的严重程度。本模型制作方法简单、经济、周期短、成功率高,主要用于UC急性炎症发作期药物治疗的疗效观察。缺点是其对结肠造成化学性灼伤,结肠炎症以急性单纯性黏膜炎症为主,与IBD致病因素差别较大,不能确切反映人类IBD免疫学和遗传学机制,亦不能反映IBD慢性、复发的特点,且自愈性强,因此目前较少使用。1.1.2慢性uc模型葡聚糖硫酸钠(dextransulfatesodium,DSS)诱导的模型目前机制尚未阐明,可能与巨噬细胞功能障碍、肠道菌群失调和DSS的负电荷影响结肠上皮DNA合成、抑制上皮细胞增生、破坏肠黏膜屏障有关。肠道菌群可能与小鼠急性期炎症有关,而T细胞介导的免疫紊乱可能与慢性期肠道病损有关。造模方法:让动物自由饮用5%DSS溶液7d,建立急性UC模型。在此基础上,继续饮用不含DSS的蒸馏水14d,建立慢性UC模型。Choi等利用DSS诱导的BALB/c小鼠结肠炎模型中研究抗癌真菌-桦褐孔菌的抗炎作用。DSS造模目前也可诱导产生UC相关性结肠癌,是研究UC及相关性结肠癌较理想的模型。其缺点是价格较高,且由于动物饮水量无法精确控制,可能造成病变差异较大。另外,豚鼠自由饮用3%角叉菜胶溶液2周后可出现明显的UC症状。其机制可能为角叉菜胶作为海藻中提取的一种硫酸多糖,通过破坏肠黏膜屏障功能,引起继发性炎症反应。该模型病变持续时间长,但因模型动物多选用豚鼠,成本较高,周期较长,不适用于人类IBD的研究。1.1.3tnbs造模研究(TNBS):TNBS作为一种半抗原,多与乙醇合用进行造模。该模型的机制是乙醇造成肠黏膜损伤后,TNBS起半抗原作用渗入结肠组织,与组织蛋白等高分子物质结合,形成全抗原,引起以Th1为主的免疫应答,继而导致与人类CD相似的炎症。以往有文献报道采用30%~50%的TNBS乙醇溶液诱导炎性肠病模型,虽然模型制备成功但死亡率较高,约为40%。王园园等采用较文献报道剂量低2%TNBS按100mg/kg体质量对大鼠进行灌肠,使死亡率降低到15%。该模型中模型病变程度由TNBS的用量及浓度决定,一般以100mg/kg为造模的最佳剂量。有日本学者利用TNBS诱导的鼠模型中研究DKT(一种草药)对CD有治疗作用。二硝基苯磺酸(DNBS)造模的机制、造模方法、临床症状及组织病理学表现与TNBS结肠炎相似,但DNBS毒性较小,价格相对也较低。TNBS造模法简单易行、经济实用,体现急性炎症向慢性转化的动态过程,是一种较为理想的动物模型,已广泛用于IBD病因、发病机制和治疗新药的开发研究。缺点是缺乏特征性急性期表现,且动物死亡率高。需要注意的是该造模方法诱导出的结肠炎模型与动物的种属相关,对该模型所属疾病还存在争议。此外,还有恶唑酮(OXZ)作为半抗原诱导的结肠炎,与人类UC类似,但由于其维持时间短,自愈性强,不适合模拟慢性复发性类型的研究。二硝基氯苯(DNCB)、2,4-二硝基氟苯(DNFB)也可以作为半抗原与载体蛋白结合,激发机体的细胞免疫反应。DNCB建立的模型接近CD,DNFB建立的模型接近UC,这两种模型由迟发过敏反应引起发病,有利于揭示IBD的免疫学发病机制。缺点是制作过程繁琐,周期较长,且DNCB毒性大,动物死亡率高。除此之外,还有用碘代乙酰胺法诱导CD的相关报道,但由于其自愈性强,不适宜模拟慢性期疾病。1.2基因缺失模型IBD具有遗传异质性,免疫调节分子基因的突变可导致炎症。为明确细胞因子及相关受体在IBD免疫发病机制中的作用,采用基因敲除或转基因技术得到特殊的针对某一因子的基因缺陷模型,是近年来IBD研究的热点。目前IBD基因工程模型主要分为基因敲除模型和转基因模型。1.2.1th1基因敲除将鼠的IL-2、IL-10、抑制性G蛋白2α亚基(Giα2)、肿瘤坏死因子(TNF)-3′末端未翻译区域(UTR)基因敲除,分别构建出IL-2-/-、IL-10-/-、Giα2-/-、TNFαARE模型(在TNF-α的3′-UTR区域有富含AU的区域(AU-richregion,ARE),所以称为TNFαARE模型),可自然发生Th1增强的免疫反应,类似人类CD。而将鼠的T细胞受体基因(TCR)和多重耐药(MDR1)基因敲除即可获得TCR-α-/-和MDR1a-/-小鼠模型,此类模型可以诱导出Th2增强的免疫反应,病理特征与人类UC类似。另外,将小鼠的胚胎干细胞的肠道三叶因子(ITF)蛋白基因进行同源重组使其失活而获得肠道三叶因子基因敲除模型。研究表明,黏膜损伤后缺失ITF小鼠的修复及再生功能极度减弱,因此认为此模型适用于研究肠道的修复功能。1.2.2hla-27细胞基因突变模型利用转基因技术将目的基因转移至动物的胚胎细胞中使之稳定在特定的组织或器官中,或在胚胎发育过程中的特定时间上表达的一类动物模型。主要包括HLA-B27转基因模型、IL-7转基因模型、信号转换和转录激活(STAT)4转基因小鼠模型和单纯疱疹病毒酪氨酸激酶转基因模型。HLA-27与人类的强直性脊柱炎相关,是一种炎症基因。STAT-4转基因小鼠可自发产生类似人类CD的结肠炎,可有腹泻、质量下降等症状,最终发展为慢性透壁性结肠炎。将小鼠的IL-7与SRα的启动子相连接,形成SRα/IL-7转基因小鼠,该模型小鼠在4~12周可观察到与人类UC相似的病变。单纯疱疹病毒酪氨酸激酶转基因小鼠可发展为空肠回肠炎。1.3小鼠骨髓cde该模型动物多选用严重联合免疫缺陷(severecombinedimmunedeficiency,SCID)小鼠,病变与人类CD类似,其发病可能与Th1型免疫反应有关。CD4+T细胞分为CD45RBhiT细胞和CD45RBlowT细胞两个亚型,有研究报道肠系膜B淋巴细胞对CD4+CD45RBhiT细胞移植后的小鼠CD模型起保护作用。该模型主要用于研究肠道抗原在IBD发病中的作用机制。1.4不与环境性动物自然界的一些动物可自发产生与人类IBD相似的肠炎,这样的肠炎模型被看作是自发性IBD动物模型。南美的白毛顶绢毛猴(cotton-toptamarin,CTT)是一种灵长类动物,笼养后可自发出现与人类UC相似的肠道炎症。笼养5年,40%的动物伴发结肠腺癌。其具体致病机制尚未阐明,但与UC病人相似的是,白毛顶绢猴发生自发的反复的结肠炎是免疫应答失调导致的。此类模型是UC及UC相关性结肠癌的理想模型。但由于动物稀少、昂贵,肠道炎症难以控制,因此在研究人类IBD的过程受到了限制。2矿物模型的出现IBD的病因和发病机制至今未明,但大量动物模型的出现为IBD的发病机制的探讨创造了有利条件。目前大多数学者普遍认为IBD是由遗传、环境和免疫等多种因素共同作用所致。2.1cd和uc对卵双生子表型的影响据调查显示,IBD患者中有5%~10%的人群有家族聚集性。同卵双生子在CD组中其表型一致率为35%,而在UC组中,其表型一致率仅占16%,这表明遗传因素对UC致病的作用小于CD,但由于同卵双生子组间差异或外界因素的影响对其数值的精确性有所限制。2.2th1和tras1-3细胞在肠道炎症中的作用免疫学因素在IBD发病中的作用至关重要。在许多动物模型的组织病理学中都发现各种细胞因子是引发肠道炎症重要的介质。Th1细胞因子如IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-18、TNF(tumornecrosisfactor)、IFN-γ(interferon-gamma)和新近发现的IL-23、IL-32、TL1A(TNF超家族成员之一)或Th2细胞因子如IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β(transforminggrowthfactor-beta)都参与了肠道炎症的发生。目前普遍认为CD主要与Th1介导的免疫反应相关,以IFN-γ、TNF-α、IL-12升高为主;而UC则与Th2介导的免疫反应密切相关,以IL-4、IL-15、IL-13升高为主。最新研究发现,在几种动物模型中如IL-10基因敲除鼠模型,CD45RB模型,螺杆菌诱导的肠炎模型,IL-23参与了Th1介导的慢性肠炎。然而,在TNBS介导的肠炎模型中发现IL-12在Th1介导的急性肠炎中有致病作用。另外,免疫学领域关于IBD的一个重要发现就是Th17细胞及其产生的细胞因子IL-17。Th17细胞和Treg(Foxp3+regulatoryT)细胞的分化都依赖于TGFβ,不同的是Th17细胞分化受促炎因子IL-6的调节,而Treg细胞分化受维甲酸(retinoicacid,RA)的调节。Shen等认为IL-23与Th17在调节肠道功能与内环境稳态方面有协同作用。2.3患者发病地区的分布和发病率近年来,IBD发病率呈上升趋势,但据流行病学调查,从分布和发病率来看,北美和北欧地区仍然是IBD高发地区。但根据调查,生活方式和其他环境因素的影响在IBD的致病机制中占据重要地位,而地域和种族的差异对其影响较小。2.3.1肠道菌群的变化大量研究表明,肠道菌群的存在是IBD发生的不可或缺的条件,肠道正常菌群的耐受性异常可能是引发IBD肠道病变的启动因子,肠内环境的改变特别是肠道菌群的变化可作为自身抗原刺激肠上皮细胞,引起机体的免疫反应,进而导致肠道炎症的发生。2.3.2吸烟对uc和cd的影响有研究表明饮食因素(高糖、高脂、低纤维素、低维生素)与IBD的发生有一定联系。吸烟对UC和CD的影响截然相反,多数研究表明,吸烟可加重CD的病情,而对UC患者则具有保护作用。有研究报道长期持续的心理压力、长期服用避孕药和非固醇类抗炎药物可加大IBD的发病几率或使其病情恶化。3动物模型的选择原则由于IBD病因的多样性和发病机制的复杂性,应用上述方法模拟的各种动物模型,都不是理想的动物模型,也不能称之为“人类IBD模型”,而只能称作“肠道炎症模型”。理想的IBD实验动物模型应具备如下特征:①实验动物应具备特定的遗传背景;②特定抗原诱导下实验动物能产生特定免疫反应;③应具备与人类I