参苓白术散对小鼠炎症性肠病的保护作用及其机制

参苓白术散对小鼠炎症性肠病的保护作用及其机制

炎症疾病（ibd）包括溃疡性胃炎（iu）和克罗恩病（cd）。这是由遗传因素、环境因素和免疫因素引起的肠内炎症疾病。研究发现IBD时可见中性粒细胞活性氧簇(ROS)的大量产生,氧化应激引起的炎症受到修饰,这可能与UC的发生和发展有关。IBD在中医学中并没有与之完全对应的病名,根据其临床特点,可归属于“痢疾”、“泄泻”、“肠癖”、“下痢”等范畴。本病的发生多由于脾气受损,湿从内生,湿滞日久,多从热化,湿热薰蒸,塞滞肠间,传导失司,与气血相搏结,损伤血络,气凝血滞,血败肉腐,内溃成疡,日久渐波及于肾、脾肾两虚。参苓白术散出自《太平惠民和剂局方》,其原方功效为益气健脾,渗湿止泻。临床研究证实参苓白术散加减方可以用于IBD的治疗,动物实验也说明参苓白术散加减方可以有效地增加结肠炎小鼠表皮生长因子(EGF)的表达,同时具有一定的保护肠上皮免疫屏障的作用。但是,参苓白术散对IBD的治疗作用以及具体机制需要进一步的探讨。本研究从动物实验入手,观察参苓白术散对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠的IBD的影响,初步探讨其可能机制。1材料表面1.1调节性抗体ros葡聚糖硫酸钠(MW5000,Fluka公司,9011-18-1);5-氨基水杨酸(5-ASA,Sigma公司,89-57-6);参苓白术散(云南白药集团股份有限公司,Z20044106);髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);活性氧(ROS)初级荧光测定试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司);鼠抗β-Tubulin单克隆抗体(Sigma公司,T6074);鼠抗IL-1β单克隆抗体(Bio-Legend公司,JAMA-147);鼠抗IL-6单克隆抗体(Bio-Legend公司,D7715A7);兔抗TNF-α多克隆抗体(博士德公司,BA0131);HRP-鼠IgG(Sigma公司,170-6516);HRP-兔IgG(武汉博士德公司,BA1020)。1.2实验动物和动物BALB/c小鼠,SPF级,动物许可证号SYXK(赣)2010-0002,雄性,6~8周龄,体重(20±2)g,购于南昌大学医学院实验动物部,饲养于清洁级动物房。1.3dna成像系统仪器GelDoc2000分子成像仪(BIO-RAD公司),电泳电源(BIO-RAD公司),DNA琼脂糖凝胶电泳仪(Bio-Rad公司),垂直电泳仪,转膜仪(BioRad公司),DNA分子成像系统(Bio-Rad公司),高速冷冻离心机(Beckman公司),台式离心机(Eppendorf公司)。2方法2.1试剂的制备DSS制备成5%的溶液;5-ASA配制成10g·L-1的溶液;NAC配制成1.33g·L-1的溶液。2.2参茯苓白术散组织正常组:按照正常饮食饮水;IBD模型组:以5%DSS自由饮用成模;低、中、高剂量参苓白术散组:IBD成模的小鼠分别再给予3,6,12g·kg-1参苓白术散ig15d;5-ASA组:IBD成模的小鼠再给予美沙拉嗪2g·kg-1ig15d。2.3粪样的观察5%DSS溶液自由饮用7d造成急性溃疡性结肠炎模型,同时予以生理盐水、5-氨基水杨酸、参苓白术散高、中、低剂量ig,每日观察进食、饮水、活动等一般情况,称量体重,观察粪便性状及粪便隐血情况。15d后,处死小鼠,取出肛门至盲肠末端的整个结肠和直肠段,部分在-80℃冰箱保存用于生化以及Westernblot分析,部分组织经甲醛固定、石蜡包埋、切片,HE染色,观察病理改变。2.4通过测定肠道组织的骨髓氧化物pmo将结肠组织制备成10%的组织匀浆,参照试剂盒方法测定结肠组织匀浆中MPO含量。2.6vict3moltilmaet预测检测血管蛋白表达根据ROS初级荧光测定试剂盒说明书,将组织称重,清洗,加入稀释液,匀浆,定量,最后将各血管蛋白调至一致浓度,各取50μL,加入染色液后于VICTOR3MultilablePlateCounter检测:激发波长485nm,散发波长535nm。RFU=(样品RFU-对照RFU)。2.7离心菌株-转糖凝胶电泳(1)蛋白提取:取出-80℃冰箱的血管组织,放入研钵中,液氮研碎;加Western及IP细胞裂解液及PMSF配制液,继续研磨,至组织样品完全裂解30min后,即可将裂解液移至1.5mL离心管中置于离心机中10000~14000×g离心3~5min,取上清,分装保存于-80℃冰箱。(2)电泳,转膜,孵育,显影:蛋白定量后,采用十二烷基硫酸钠-变性聚丙烯酰胺凝胶不连续缓冲系统,进行电泳。然后将蛋白转移到PVDF膜上,将PVDF膜放入抗TNF-α,IL-1β与IL-6等一抗(1∶400)中孵育,4℃过夜,清洗,加入二抗常温下孵育1h,清洗,显影。2.9病理评分标准由有经验病理医生对结肠组织学损伤进行评分,每个切片随机选取15个高倍视野(400倍)计分,取其平均值。评分标准如下:炎症:无为0分;轻度1分;重度2分。病变无0分;黏膜下层1分;肌层2分;浆膜层3分。隐窝破坏无为0分;基底1/3破坏1分;基底2/3破坏2分;仅有完整表皮3分;全部隐窝和上皮破坏4分。病变范围1%~25%,1分;26%~50%,2分;51%~75%,3分;76%~100%,4分。2.10统计方法计量资料采用表示,统计分析采用SPSS11.5软件,计量资料组间比较用t检验,P<0.05有统计意义。3结果3.1小鼠小鼠dai积分DAI积分是从小鼠的症状、体征及大便情况反映溃疡性结肠炎病情严重程度的一种积分形式,它是由粪便隐血便血、粪便性状及体重变化3个指标组成。实验前各组小鼠的DAI积分无显著性差异,饮用DSS后除正常组外各组小鼠DAI积分随时间而开始逐渐升高,反映结肠炎的病情在逐渐加重。而模型组的DAI积分较5-ASA组、不同剂量的参苓白术散高,差异具有显著性(P<0.05),各组与正常组比较均具有显著性差异(P<0.05),见表2。3.2结肠组织病理学检测正常组结肠黏膜结构完整,无炎性细胞浸润,与各组积分有显著性差异(P<0.01)。模型组、盐水组结肠黏膜上皮细胞广泛缺失,腺体大多数不完整,炎症细胞广泛浸润,呈典型炎症改变;5-ASA组、参苓白术散组结肠黏膜腺体基本完整,局部有少量炎性细胞浸润或隐窝破坏,与模型组、盐水组比较有显著性差异(P<0.05)。见表2以及图1。3.4参茯苓白术散对tnf-、il-6表达的影响与正常组比较,模型组的TNF-α,IL-1β以及IL-6的表达明显升高,而不同质量浓度的参苓白术散可以显著地降低TNF-α,IL-1β以及IL-6的表达水平,见图2。4参茯苓白术散对ud病理变化的作用IBD发病时,肠黏膜中大量的吞噬细胞从血液循环入肠黏膜层和黏膜下层,当它们在吞噬异物或被激活后,增加耗氧量导致黏膜细胞脂质过氧化损伤,同时生成非自由基的过氧化氢,后者能与超氧阴离子自由基相互反应,生成具有更高活性的羟自由基(OH·),对肠黏膜的危害非常大。MDA是脂质过氧化反应的产物,其含量反映了组织中过氧化损伤程度,它本身能使肠黏膜组织损害进一步加重。MPO存在于中性粒细胞中,是反应中性粒细胞浸润的数目多少,该指标较灵敏地反映组织中性粒细胞浸润损伤的程度。本实验发现参苓白术散能够明显地减少IBD模型的肠组织中ROS,MDA,MPO的含量,提示它对DSS诱导的氧化损伤以及炎症损伤有一定的保护作用。IL-1是IBD发病中一个重要的细胞因子。IL-1与受体结合后,通过核转录因子-κB(NF-κB)激活包括IL-6在内的多种细胞因子。研究显示IBD患者黏膜固有层单个核细胞IL-1β,IL-6水平的表达升高,且表达水平与黏膜的炎症和坏死、疾病严重程度、累及范围以及是否复发有关密切相关;TNF-α是IBD发病中很重要的损伤性细胞因子之一,炎症肠段的炎性细胞所分泌的TNF-α能进一步损伤结肠组织,放大肠道炎症反应,抑制TNF-α的合成、分泌能有效地抑制肠道局部炎症反应,TNF-α是UC炎症级联反应的中心分子。中医中虽无IBD此病名,但有类似病变和临床表现的论述,本病应属于祖国医学“泄泻”、“痢疾”、“便血”、“肠僻”“大瘕泄”等病证范畴。脾虚是发病之根本,多种致病因素导致脾失健运,湿热蕴结肠腑,大肠传导失司,肠络受损,血败肉腐,最终内溃成疡。研究显示,中医“脾”的概念与机体免疫功能密切相关,脾虚通过影响黏膜相关的IgA、SIgA分泌,下调免疫应答的效应T细胞,破坏黏膜免疫系统,TNF-α,IL-1,IL-6等促炎因子的增多,IL-10抑炎因子的减少。参苓白术散出自《太平惠民和剂局方》,其原方功效为益气健脾,渗湿止泻。方中人参、白术、茯苓益气健脾渗湿为君,配伍山药、莲子肉助君药以健脾益气,兼能止泻;并用白扁豆、薏苡仁助白术、茯苓以健脾渗湿,均为臣药。更用砂仁醒牌和胃,行气化滞,是为佐药。桔梗宣肺利气,通调水道,又能载药上行,培土生金;炒甘草健脾和中,调和诸药,共为佐使。综观全方,补中气,渗湿浊,行气滞,使脾气健运,湿邪得去,则诸症自除。临床研究证实参苓白术散加减方可以用于IBD的治疗,动物实验也说明参苓白术散加减方可以有效地增加结肠炎小鼠表皮生长因子(EGF)的表达,同时具有一定的保护肠上皮免疫屏障的作用。本实验研究发现,参苓白术散能改善DSS引起的小鼠体重下降、隐血、便血等症状,降低DAI积分及组织病理损伤评分等,同时使得ROS,MDA,MPO含量较模型组显著下降,表明参苓白术散能缓解DSS诱导的结肠炎症状,减轻黏膜组织损伤和炎症损伤程度;研究还发现正常组小鼠结肠组织基本不表达IL-1β,IL-6,TNF-α,而模型组小鼠结肠组织的IL-1β,IL-6,TNF-α的蛋白质表达均开始上调,其表达的多少同样也与DSS诱导的结肠炎的症状呈正相关,而不同剂量的参苓白术散有抑制IBD结肠组织的IL-1β,IL-6,TNF-α的蛋白质上调的作用,说明参苓白术散抗IBD与抗氧化应激以及