western blot相关技术的操作与原理

WesternBlot相关技术的原理与操作

解放军总医院分子生物学研究室宋海静1◆

实验目的●

掌握细胞总蛋白提取技术●

掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术

●掌握蛋白质转印及抗体染色技术

●

掌握ECL试剂的使用、X-片曝光及显影方法

2

实验原理

●

将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

[SDS-olyacrylamide

gelelectrophoresis],对不同分子量的蛋白质进行分离

●将分离到的蛋白质通过转移电泳方式转印至固相支持物上(PVDF膜硝酸纤维素膜或尼龙膜上)●

用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印膜进行反应，使其与膜上的靶蛋白发生特异性结合.3●

结合上的抗体与辣根过氧化物酶标记的二抗进行结合;●

经ECL发光试剂作用、X-光片曝光、显影既可显示与特异抗体结合的靶蛋白条带。

4一抗一抗一抗(兔抗Actin)

曝光后的蛋白条带二抗(辣根酶标记的羊抗兔IgG)ECLX光片曝光显影ECL试剂含有转印蛋白的PVDF膜

++转印膜上蛋白检测示意图

5◆实验分为三个部分●

细胞总蛋白质的提取及含量测定；●

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳●

凝胶转膜及其检测6

♣

实验流程

提取细胞总蛋白、测定含量

↓

制备SDS胶

↓

蛋白样品变性、电泳

↓

凝胶转膜↓

封闭(室温1小时)↓

一抗反应(4℃过夜)↓

二抗反应

(室温、避光50分钟)↓ECL试剂作用

↓

X-光片曝光、显影

↓

结果分析

7

♣

实验方法

8

第一部分

细胞总蛋白的提取及含量测定

9◆

细胞总蛋白裂解液

1XPBS

80ml

Tritonx-1001ml去氧胆酸钠0.5g

SDS

0.1g补1xPBS缓冲液至100ml

PMSF储存液(100mmol/L)

★PMSF储存液为17.4mg/ml异丙醇

-20℃保存.

10☻

提取细胞总蛋白

选取于60mm细胞培养皿中培养的

Hela

细胞(细胞数约为5X106/培养皿）

↓

吸弃细胞培养液，用4℃预冷的1XPBS洗细胞表面3～4次（－80℃冻存,至少可保存两周)↓（由－80℃取出冻存细胞）每培养皿加入100ul蛋白裂解液，轻轻晃动，使裂解液均匀铺于细胞表面↓

冰浴

40分钟，期间晃动3~4次

↓

用细胞刮子集中裂解液，收入1.5mlEP

管中，

12,000g4℃离心20min↓

小心吸取上清液并分装，-80℃保存

11

★

提取细胞总蛋白注意事项

●

FMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸入、进或通过皮肤吸收有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，立即用大量水冲洗.

●PMSF(苯甲基磺酰氟)在水溶液中不稳定,应在临用前加入，使终浓度为1mmol/L(10ul储存液/ml裂解液)

12

●

为防止蛋白降解，操作全部应在冰上完成,所用离心机需提前预冷.

●

提取的蛋白质样品应小量分装,冻存于-80℃,切勿反复冻融已制备好的样品。13☻

蛋白质含量测定

◆

测定意义

●

为确保蛋白质通过SDS获得最好分离效果,有必要对提取的蛋白质总量做粗略的估计

●

蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定;蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至会影响此电泳方法的分辨力

14◆

蛋白质含量测定常用方法

●

标准Bradford分析法

●

双缩尿测定法

●

紫外光谱吸收法

●

Folin酚法

15☻

测定细胞总蛋白含量步骤(Bradford)

◆

制作样品蛋白标准曲线

将牛血清白蛋白(BSA）用生理盐水配制成

0.5mg/ml的标准品蛋白，４℃保存

↓用PBS稀释上述标准品蛋白，使成

0、2、4、6、8、10ug/100ul

分别编号为1、2、3、4、5、6

↓

每管中分别加入1.5ml考马斯亮蓝使用液

↓

紫外分光光度计上测定595nm吸光度值

↓

依据所得读数制作标准曲线图

16◆

测定样品蛋白浓度吸取适量样品蛋白加至PBS中使总体积至100ul

↓向上述管中加入1.5ml考马斯亮蓝使用液

↓

测定595nm吸光度值

↓

将所得读数与标准曲线图比对，从而推算出蛋白样品浓度

17

◆

标准曲线及待测蛋白样品稀释方法

编号加样量生理水量考马斯亮蓝实际浓度（ＢＳＡ）

1０ul

100ul

1500ul０ug/100ul

2

4ul

96ul

1500ul

2ug/100ul

3

8ul

92ul

1500ul

4ug/100ul

4

12ul

88ul

1500ul

6ug/100ul

5

16ul

84ul

1500ul

8ug/100ul

6

20ul

80ul

1500ul

10ug/100ul

蛋白样品

1

2ul

98ul

1500ul

ug/100ul

2

2ul

98ul

1500ul

ug/100ul

3

2ul

98ul

1500ul

ug/100ul

4

2ul

98ul

1500ul

ug/100ul

18

19BSA浓度OD值

2ug

0.08

4ug0.169

6ug0.265

8ug0.327

10ug0.377

20★

测定蛋白含量注意事项●

制作的BSA标准曲线如不规律，应重新再做●

如果待测样品浓度过高（如组织提取物)，可用生理盐水将其稀释10～20倍后测定；如样品浓度低，可适当增加样品微升数或减少水的微升数.

●

比色皿的清洁：考马斯亮蓝不易被清水冲洗干净，因此使用后的比色皿除用清水冲洗后，还需用无水乙醇将比色皿浸泡数分以脱色，而后分别用自来水、蒸馏水冲洗后备用。21

第二部分

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

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◆原理

●

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是对蛋白质做定性分析的常用的实验方法,适用于蛋白质纯度检测和分子量测定

●

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分为只有分离胶的连续系统和既有分离胶又有浓缩胶的不连续系统.

●

连续系统的电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

23●

在不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力.当样品首先通过高度多孔性的积层胶时，样品中所含

SDS多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层），因此其分离条带的清晰度及分辨率均较高。24

●

SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度.在进行电泳时,蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小

.

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ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围

丙烯酰胺浓度(%)线性分离范围／KDa

15

10-431212-601020-807.536-945.057-21226●

对蛋白质样品做SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析时，要在样品中加入含有SDS（十二烷基磺酸钠）、

-巯基乙醇、指示剂及甘油或蔗糖的电泳上样液．●

SDS是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；

-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键．27●

蔗糖或甘油可以增大上样溶液的密度，有助于加样时样品溶液沉入加样孔底部;●

样品蛋白中加入电泳上样液后，要经过高温处理，使SDS与蛋白质充分结合，造成蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构;●

电泳上样液中通常含有溴酚蓝染料做指示剂，用于控制电泳过程;

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制备SDS凝胶程序

●

制备电泳用玻璃凝胶槽

●

确定灌制分离胶液面标志线

2930

◆配制分离胶和浓缩胶

配制10%SDS分离胶(15ml)5%浓缩胶(4ml)

去离子水5.9ml2.7ml30%丙烯酰胺5.0ml0.67ml1.5mol/LTris-ClpH8.83.8ml/1.0mol/LTris-ClpH6.8/0.5ml10%过硫酸胺0.15ml0.04ml10%SDS0.15ml0.04ml

ＴＥＭＥＤ（临用前加入）

0.008ml0.004ml

●

取上述分离胶1ml,加入TEMED3ul,混匀后用其封电泳用玻璃夹板周边至其凝固．

31◆

灌制分离胶

●

在分离胶液中加入6ulTEMED，混合均匀，迅速用巴斯德吸管轻轻加入玻璃凝胶槽中，直至液面标志线处．●

立即用

0.1%SDS液覆盖胶面，室温放置约40分钟至分离胶凝固。32

●

轻轻倒掉0.1%SDS覆盖液，去离子水冲洗分离胶表面2-3次，洗净未聚合的丙烯酰胺凝胶，用吸水纸吸掉残留的液体。

●

将凝胶板垂直放置，轻轻加入5%积层胶液，插入样品梳，室温凝胶约40分钟。33◆蛋白样品变性●由-80℃冰箱取出细胞总蛋白样品，立即插入冰中（减少蛋白降解）待其融化●

吸取15ul细胞总蛋白样品,加入4×蛋白质凝胶电泳上样液,将二者轻轻混合,98℃变性8分钟,立即插入冰中

●vortex数秒，短暂离心后轻轻加入凝胶孔中

34◆

电泳●

正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以保证电荷由负极向正极方向流动。●

接通电源,将电压调至100V,使样品通过浓缩胶（电压约

8v/cm）;当染料进入分离胶后，将电压调高到130V

（约15v/cm)继续电泳,染料至分离胶适当位置时结束电泳

●

尽量在4℃冰箱中进行电泳

3536★制备凝胶及电泳中注意问题●

丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积性,故称量时应戴手套及口罩●

不同厂家的SDS可引起多肽的迁移图谱变化较大，建议找出个人喜欢的某一试剂级别并认准使用

●

电泳同时设立标准蛋白分子量Marker37●

过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制;●

一旦加入TEMED，应立即混旋并快速灌注入玻璃夹槽中;●

为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的4x

蛋白质电泳上样缓冲液;

38●

制备凝胶电泳用玻璃板的硅化处理

将二氯二甲硅烷用氯仿或庚烷配成5%溶液，用其浸泡或擦拭玻璃板,有机溶剂挥发时，二氯二甲硅烷即沉积在玻璃制品上。使用前用水反复冲洗多次或于

180℃烘考2小时。

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第三部分

凝胶转膜及其检测

通过电转移法将ＳＤＳ－PAGE胶上分离到的蛋白质转印至PVDF膜上

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◆

转膜步骤●

PVDF膜预处理：剪裁与胶大小一致的PVDF膜，将其浸入甲醇液中浸泡10sec、去离子水中浸泡

5min、1X转移缓液中浸泡至少15min。●

剪裁与胶同样大小的6层滤纸，用转移缓冲液打湿后待用。

41●

电泳结束后由电泳槽上取下电泳板，将其平置（“凹”面玻璃板在下）,小心取出两玻璃板之间的垫片，掀去上层玻璃板，切除多余凝胶，将样品胶在转膜液中漂洗一次。

42

●

安装转膜板：

打开转膜夹板,由阳极侧开始,依次为海绵垫片→3层滤纸→PVDF膜→样品凝胶→三层滤纸（排除气泡）

→海绵垫片4344胶45●

扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中。●

接通电源，恒压状态下，80v转膜2h（此步操作宜在4℃冰箱中进行）。

464748★

注意●

为避免操作中的失误,在转移前将膜与胶做同侧标记；●

检查样品凝胶是否与转移槽的

“-”侧保持一致,以

确保样品蛋白由凝胶转移至PVDF膜.

49◆

封闭转印膜●

转移结束后,小心取出转移膜（用铅笔轻轻瞄出蛋白

Marker带），在1XTBST液中漂洗两次

●