反相液相色谱法测定性疾病食品中多种磺胺类药物残留

反相液相色谱法测定性疾病食品中多种磺胺类药物残留

磺胺类药物是氨基苯磺胺（sn）的衍生物，是肉类中常见的抗炎药物。随着某些磺胺类药物毒副作用的突出和人们安全意识的提高，所有国家都对磺胺类药物的上市有严格的要求。例如，联合国药物管理局、欧盟、日本和中国的许多国家要求动物产品中磺胺类药物的总量和氨基丙烯酸磺酸盐的单一药物含量不得超过0.1mg。因此，我们必须监控动物、家禽和其他野生动物产品中磺胺类残留，特别是磺酰胺（sd）、磺酰胺酰胺（sm2）、磺酰胺对甲氧吡啶（smr）和磺胺类药物的快速检测方法。多种磺胺类药物残留的液相色谱分析大都采用梯度洗脱,样品用固相萃取柱净化。本实验采用简单的液-液萃取、等度洗脱方式对磺胺(SN)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺对甲氧嘧啶(SMR)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺喹恶啉(SQX)等六种磺胺类药物残留进行分析。1材料和方法1.1检测仪器和色谱核心设备美国Waters高效液相色谱系统,包括1525泵、2487紫外双波长检测器、7725i手动进样器和Empower色谱工作站。磷酸、正丙醇、无水硫酸钠均为分析纯;乙腈、正己烷均为色谱纯。1.2流动相、流速:乙腈-0.2%h3po4流动相,流动相1.色谱柱:KromasilC18柱(250×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-0.02%H3PO4(体积比28:72),波长:268nm,流速:1.0ml/min,样量:20μl。以保留时间定性,峰面积定量。1.3smr、酰胺氯咯嗪、酰胺羟基恶啉sqx、白砂糖的制备磺胺类药物标准储备液:称取磺胺(SN)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺对甲氧嘧啶(SMR)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺喹恶啉(SQX)标准品(购自美国Sigma公司,纯度不小于99%)各(5.0±0.7)mg,分别置于六个25ml棕色容量瓶中,用甲醇超声溶解,并定容至刻度,混匀,4℃避光存放。配制系列浓度的混合标准工作液,按1.3进行测定,结果见表1,混合对照品色谱图见图1。1.4提取乙腈提取液分别称取2.5g匀浆试样,置于两个10ml离心管中,各加入8ml乙腈和5g无水硫酸钠,均质后以3000r/min离心5min,将上清液(乙腈层)移入分液漏斗中,离心后的沉淀物加入8ml乙腈摇匀,超声波提取30s,于3000r/min离心5min,合并乙腈提取液。在乙腈提取液中加入16ml乙腈饱和正己烷溶液,振摇5min,将底层乙腈液移入梨形瓶中,加入10ml正丙醇,用旋转蒸发仪减压浓缩至近干,用氮气吹干。在残留物中加入1.0ml乙腈-水溶液(1+1)超声30s溶解残渣,将溶解液移入10ml离心管中,加0.5ml乙腈饱和正己烷溶液,以3000r/min离心5min,弃去正己烷层,将底层乙腈水溶液用0.45μm微孔滤膜过滤,收集滤液作为试样溶液,供高效液相色谱法测定,猪肝样品色谱图见图2。2结果与分析2.1色谱条件选择分别考察了乙腈-磷酸缓冲盐、乙腈-水及乙腈-磷酸溶液对六种磺胺的分离效果:以乙腈-磷酸溶液体系效果最佳,因为乙腈-水中加入的磷酸可有效抑制色谱峰拖尾。当磷酸浓度为0.02%且乙腈-0.02%磷酸溶比例为28:72时,各组分较好地分离,并且等度洗脱可保证各组分保留时间完全重现,有利于样品分析。2.2精密度实验选取一种浓度的混和标准工作液,进样20μl,重复进样6次,得出六种磺胺的峰面积,其RSD在1.1%～2.7%之间。2.3主体市场中胺氧化酶含量检测结果同时称取六份猪肝样品,参照本实验方法进行测定,结果磺胺含量(mg/kg)为:1.16、1.23、1.26、1.24、1.19、1.30,平均结果为1.23mg/kg,RSD为4.05%;磺胺嘧啶含量(mg/kg)为:1.75、1.77、1.81、1.91、1.71、1.79,平均结果为1.79mg/kg,RSD为3.80%;磺胺二甲嘧啶等其余四种没有检出。2.4重建和回收率实验对猪肝样品加入高中低浓度的混合对照品,回收率结果及RSD值见表2。2.5方法二波长面积比如样品检测出阳性,可改变流动相比例进一步证实,比较样品色谱峰保留时间是否和标准色谱峰一样改变,也可利用仪器的双波长检测的功能,设置第二波段,比较样品及标准在两个波长下的面积比是否一致。如有二极管阵列检测器,可借助于三维图谱及多波长同时检测进行确认。2.6乙腈系磺胺类磺胺类药物一般采用二氯甲烷进行提取,但二氯甲烷有可能提取出类脂物,浓缩后不容易脱脂。乙腈是提取磺胺的合适溶剂,它在沉淀样品中蛋白质方面优于甲醇等,故本法采用乙腈将样品中的磺胺类提取出来,再用乙腈饱和的正已烷除去脂溶性杂质,以脱去脂肪,减少杂质的干扰。加入正丙醇的目的是加快蒸馏的速度,并且能够减少药物的损失,提高回收率。最后将乙腈层减压浓缩至干用1:1乙腈-水溶解,再用乙腈饱和的正已烷萃取脱脂一次后,直接上机,无需过固相萃取柱,大大简化了实