间接竞争elisa法检测肉鸡中的磺酸类成分

间接竞争elisa法检测肉鸡中的磺酸类成分

兽药（包括药物提取物）广泛应用于畜牧业。它在减少发病率和死亡率、促进生长、提高饲料利用率和改善食品状况方面发挥着重要作用。这是现代牲畜不可或缺的基础。食用含有残留兽药的动物性食品后,一般对人不表现急性毒性作用,但如长时间摄入低剂量残留兽药的动物性食品,则可造成兽药在人体内蓄积引起各种组织器官发生病变,甚至癌变。因而加强兽药残留的监控和检测工作具有重要的意义。世界各国对SQX的残留问题非常重视,并且投入大量经费进行危害分析、控制用量及检测方法等方面的研究。本实验采用间接竞争ELISA方法对鸡肉中的磺胺喹恶啉进行检测。1材料表面来自于吉林某肉食鸡养殖场,随机抽取23个样品,宰杀后取胸肉和腿肉。试验中使用的酶制剂和生化制剂均购自相关的技术公司。2方法2.1器振荡20min用均质器均质样本,然后取2.0±0.05g的均质物至50mL聚苯乙烯离心管中,加入8mL乙晴,立即用振荡器振荡20min,3000r以上离心5min;取上层清液置于2.5mL至10mL干净的玻璃试管中,于50～60℃水浴氮气流下吹干;加入1mL正己烷,用涡旋仪涡动20s溶解干燥残留物,再加入1mL0.2M磷酸盐缓冲液,用涡旋仪涡动1min,3000r以上离心10min除去上层正己烷相,取下层20L用于分析。2.2测试步骤2.2.1种液体试剂的使用将所需试剂从冷藏环境中取出,置于室温(20～25℃)平衡30min以上,注意每种液体试剂使用前均需摇匀。2.2.22.2.32.2.4编号将待测样品和标准品对应微孔按序编号,每个样品和标准品做2孔平行,并记录标准孔和样品孔所在的位置。2.2.5免疫二抗反应加标准品/样品各20L到对应的微孔中,然后加入酶标二抗50L/孔,再加入抗体工作液80L/孔,轻轻振荡摇匀,用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应60min。2.2.6吸水纸拍干法小心揭开板膜,将微孔内液体甩干,用洗涤工作液250L/孔,充分洗涤4～5次,每次间隔10s,用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。2.2.7显色加入底物液A液50L/孔,再加入底物液B液50L/孔,轻轻振荡摇匀,用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min。2.2.8酶检测要求加终止液50L/孔,轻轻振荡摇匀,设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测,在5min内读完数据),测定每孔OD值。(若无酶标仪,则不加终止液,用目测法可进行判定)。3结果3.1酰胺喹恶啉残留量的计算本次实验实际得出标准品磺胺喹恶啉的残留量与标准品理论上磺胺喹恶啉的残留量有一定的偏差见表1。3.223个样品的sqx保留经过分析,试验中23份样本的残留量见表2。4讨论4.1固相抗体反应固相竞争ELISA法,用来测定小分子抗原,受检抗原和酶标抗原竞争性地与固相抗体结合,因此,结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量成反比。将特异性抗体与固相载体联结形成固相抗体,洗涤、封板;待测管中加受检样品与一定量酶标抗原的混合液,使之与固相抗体反应。如受检样品中无抗原,则酶标抗原能顺利的与固相抗体结合。如果受检样品中有抗原,这些抗原会与固相抗体结合占去了酶标抗原与固相抗体结合地机会。加底物显色时,对照孔中由于结合地酶标抗原量最多,故颜色最深,待测孔颜色越浅,表示样品中抗原量越多。4.2试验溶液的选择4.2.1对药物的结合程度由于磺胺类药物的两性和极性,使它在不同溶剂中均有一定的溶解度,通过多次萃取即可达到定量回收,但由于样本基体不同,如其中的脂肪、蛋白质、糖分和水分的含量不同,对药物的结合程度以及存在的干扰物质也有所不同。如饲料样本的脂肪、蛋白质和水分含量均比较少,一般采用含水的提取液比较好。组织样本中的脂肪含量较高,而磺胺主要为水溶性,一般采用极性有机溶剂进行提取以避免提取过多的脂肪。4.2.2缓冲区缓冲区选择ELLSA用的包被缓冲液有磷酸盐缓冲液和PBS,经大量试验表明:用磷酸盐缓冲液的效果好。4.3反应温度和有效温度的考察温度对实验结果的影响:室温低于20℃或试剂及样本没有回温到室温(20～25℃)会影响实验结果,导致所有标准的OD值偏低。本实验最佳反应温度为25℃,温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。试剂与材料的影响:本实验中的药品保存时间过长或者温度过高都会引起活性下降或失效,因此实验药品应该规定实验温度和有效期。另外为防