整个基因克隆实验规程

组织总RNA的提取相关试剂：Trizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200皿、100皿/50皿）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200皿/300皿），一次性手套，实验手套。实验步骤取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50〜100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解；按1mlTrizol加入200四l氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min；4°C，，12000g离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；室温放置10min；4C，,12000g离心10min；弃上清，加入1ml75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4C，,12000g离心5min；弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀；弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解）沉淀中加入30plRNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。RNA质量检测相关试剂：漠酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，漠乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5叫或2叫规格，10^规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1） RNA纯度的检测:测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/OD280的比值，当其比值在1.9〜2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。（2） RNA完整性的检测：取2plRNA，与2叫漠酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。二、逆转录（RNA逆转录成cDNA）相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5^或2叫规格，10^规格），100叫冰盒，制冰机，PCR管）

根据逆转录试剂盒（TOYOBO公司）说明书进行，反应体系及条件如下:试剂使用量（pl）RnaseFreeH2O11.75-YOligo(dT)1TotalRNAY(<1000ng)TotalVolume12.7565°C，5min后，立即置于冰上。试剂使用量（pl）上步变性后RNA溶液12.755XRTBuffer4dNTPMixture(各10mM)2RnaseInhibitor(10U/pl)0.25ReverTraAce1TotalVolume20然后放置于PCR仪上，反应程序为：42C,60min；99C,5min；16C,5min。所得cDNA放置于-20C保存。三、 PCR反应相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5四1或2pl规格，10pl规格），100pl电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）反应条件：95C,预试剂使用量（pl） 变性3min；94C变性30s，55C退火ddH2O6.0 30s，72C延伸45s，共35个循环；72C反转录产物1.0 延伸10min。反应结束后，取5叫10XPCRBuffer1.0 PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。dNTP(10mmol/l)0.2Taq酶(1U/ql)0.4Ghrelin-F(10四mol/l)0.4Ghrelin-R(10四mol/l)0.4MgCl2(25mmol/l)0.6TotalVolume10四、 PCR产物的分离，回收和纯化相关试剂：胶回收试剂盒相关仪器：（紫外照胶仪，移液器（200^1,1ml规格），离心机，恒温金属浴，涡旋混匀仪，制冰机，超微量分光光度计）相关耗材：（切胶刀片，吸头，离心管架）PCR反应得到目的条带后，加大反应体积，然后根据胶回收试剂盒说明书进行目的片段的回收纯化。将所得DNA贮存于-20°C。五、 目的片段与载体的连接相关仪器：（恒温金属浴，移液器（10四1，2.5四1规格）涡旋混匀仪，制冰机）按照连接试剂盒（TAKARA公司）说明书进行操作。pMD-18T载体 1^1DNA 2^1ddH2O 2皿 然后加入5p1LigationMix，4C/16C放置过夜连接。六、 转化相关仪器：（超净工作台，离心机，恒温培养箱，恒温摇床，恒温金属浴/水浴锅，移液器（1000^1，100^1，10四1，2.5四1规格）涡旋混匀仪，制冰机）►CaCl2法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞全过程冰上进行，4C离心，无菌操作。（1） 以接种环从-80C保存的高效转化菌种蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12h；（2） 挑取单菌落接种于1ml无抗生素LB培养基中，37C剧烈震荡培养6h；（3） 按1:100接种菌液于25mlLB液体培养基中，37C震荡培养1.5〜2h，至OD600达0.4〜0.6；（这一步非常关键，培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA的能力较低，从而导致转化率降低）（4） 冰上预冷10min；然后4C，6000rpm离心10min；（6） 弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于25ml预冷的0.1MCaC12中，冰浴20min；（7） 4C，6000rpm离心10min，弃尽上清；（8） 以1.25ml（菌液体积的5%）预冷的0.1MCaC12溶液重悬细菌沉淀，同时加入0.3ml预冷的100%甘油（甘油终浓度达15〜20%），混匀后按每支100^1在冰上分装。-80C保存备用。►连接产物转化到感受态细胞（1） 将10四1连接产物加入100^1感受态菌液中，冰上放置30min；（2） 然后放到42C水浴锅中热激90s，再在冰上放置3min；（3） 加入890^1LB液体培养基，37C震荡培养60min；（4） 每个培养平板中加入40^1X-ga1和4^1IPTG，然后吸取100^1菌液，均匀涂布于含Amp的LB固体培养基平板上；（5） 37C培养箱中正放1h，待菌液被琼脂完全吸干后，倒置平板，过夜培养16h。（培养时间不宜过长，否则有卫星菌落产生）七、 菌液PCR检测相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，涡旋混匀仪，移液器（10规格，1000^1规格），100^1电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）在平板上挑取10〜20个白色菌落，加入含有1mlAmp+LB液体培养基的1.5ml离心管中，37C震荡培养6h。3000rpm离心3min后吸掉上层400^1上清液，短暂涡旋将沉淀打散，然后把菌液当成模板，按上面PCR方法进行扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测是否含有目的条带。挑选扩增出正确目的条带的菌液送公司测序。附注：主要溶液和培养基的配制电泳缓冲液10XTBE：108gTris碱，55g硼酸，20ml0.5M的EDTA，加入蒸馏水混匀后定容至1000ml，调节pH为8.0；LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g；加800ml去离子水，用10MNaOH调节pH至7.0，定容至1000ml，高压(1.034X100000Pa)灭菌20min，4°C保存；LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5%，高温、高压灭菌20min后降温至50〜60C，在无菌状态下铺制平板，室温放置过夜后，置于4C保存；氨苄青霉素贮存液：用无菌双蒸水配成100mg/ml，分装，-20C保存。使用时终浓度为100ug/ml。用于制备感受态细胞的CaCl2(0.1mol/l)：称取0.56gCaCl2(无水，分析纯)，溶解于50ml双蒸水中，定容至100ml，高压灭菌；X-gal(20mg/ml)的配制：将20mgX-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20C避光保存；IPTG(200mg/ml)的配制：将0.2gIPTG溶于1ml去离子双蒸水中，0.22“m滤膜除菌，-20C保存备用；(dT)17-接头引物：5’GACTCGAGTCGACATCGA(T)173’接头引物：5’GACTCGAGTCGACATCG3’1.cDNA的合成DEPC水9.75|ilOligodT接头引物1plTotalRNA2|il(<1000ng)65°C,5min；立即置于冰上。第步变性后的RNA溶液12.75|il5XRTBuffer4pldNTPMixture(各10mM)2|ilRnaseInhibitor(40U/pl)0.25|ilReverTraAce1pl总体积20|il反应条件：42C,60min；99C,5min；16C,5min。cDNA的纯化利用胶回收试剂盒进行（去除多余的dNTP和引物）。最后使用20^1TE洗脱沉淀。第一轮PCRcDNA1pl10XBuffer1pldNTP(10mmol/L)0.2|ilOligodT接头引物(10|imol/L)0.4|il3’RACE外引物(10pmol/L)0.4|ilTaq酶(1U/|il)0.4plMgCl2(25mmol/L)0.6|ilddH2O6.0|il反应条件：降落PCR。 PCR产物稀释10倍作为模板进行下游实验。4.第二轮PCRcDNA1pl10XBuffer1pldNTP(10mmol/L)0.2|il接头引物(10|imol/L)0.4pl3’RACE内引物(10pmol/L)0.4|ilTaq酶(1U/|il)0.4plMgCl2(25mmol/L)0.6|ilddH2O6.0|il反应条件：降落PCR。1.cDNA的合成DEPC水9.75|il基因特异性反义引物1plTotalRNA2|il(<1000ng)65°C,5min；立即置于冰上。第步变性后的RNA溶液12.75|il5XRTBuffer4pldNTPMixture(各10mM)2|ilRnaseInhibitor(40U/pl)0.25|ilReverTraAce1pl总体积20|il反应条件：42C,60min；99C,5min；16C,5min。cDNA的纯化利用胶回收试剂盒进行（去除多余的dNTP和引物）。最后使用20^1TE洗脱沉淀。cDNA的加尾纯化后的cDNA5.7|il5X末端转移酶缓冲液2|il1mmol/ldATP2|il末端转移酶（30U/pl）0.3|il总体积10|il反应条件：37C,60min；70C,10min。反应结束，把cDNA稀释1倍作模板进行下游实验。4.第一轮PCRcDNA1pl10XBuffer1pldNTP(10mmol/L)0.2|ilOligodT接头引物(10|imol/L)0.4|il5’RACE外引物(10pmol/