多菌种发酵混合混合混合防腐剂的研究

多菌种发酵混合混合混合防腐剂的研究

腐腐食是中国著名的传统发酵食品和香料之一。它由各种微生物（即大豆、蛋白）制成，口感独特，口感清新，口感细腻，营养丰富。它以大豆为原料,经过磨浆、制坯、前期培菌、腌制、后期发酵而成。在我国,霉菌型腐乳最为常见,即在豆腐坯表面通过人工或天然的接种霉菌进行前期培菌而成。霉菌型腐乳包含毛霉腐乳和根霉腐乳,根霉型腐乳产量较少。毛霉是新法生产腐乳的主要菌种,其生长温度一般都在15～25℃,不能在炎热季节用于腐乳生产。导致了许多工厂夏季停产,造成管理不善和经济损失。为了解决上述问题,筛选出耐热性强的菌株一直是腐乳研究热点之一,但是结果并不理想。腐乳酿造过程中,最主要的生化变化是霉菌分泌蛋白酶,将豆腐中的蛋白质分解。毛霉分泌蛋白酶量较大,但不耐高温;根霉比较耐高温且可分泌较多的脂肪酶等其他酶系,但是分泌蛋白酶的能力相对较弱。本试验在高温条件下利用了多菌种酿造腐乳以突破单菌接种培养的局限性,利用了菌种自身优点来弥补相互的弱点,在解决夏季停产问题的同时,达到丰富酶系,使产品风味更佳的目的。1材料和方法1.1材料表面市售新鲜豆腐,马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA),可降解一次性饭盒。1.2该菌株的来源雅致放射毛霉(CICC3118),米根霉(CICC3037)均购于中国工业微生物菌种保藏中心。1.3计数板、游标卡尺、灭菌锅、电子天平、数水浴箱、电子天平、电子天平、电子天平、电子天平、数量瓶鼓风电热干燥箱、霉菌培养箱、显微镜、血球计数板、游标卡尺、灭菌锅、723N可见光分光光度计、精密酸度计、磁力搅拌器、恒温水浴箱、离心机、电子天平、研钵、称量瓶。1.4测试方法1.4.1养物活化的测定将雅致放射毛霉和米根霉接种到PDA斜面,分别置于28,30℃培养3～5天后置于4℃冰箱,使用前在培养箱中活化过夜。在斜面上加入5mL无菌水,用无菌接种环将菌丝捣碎,倒入含有玻璃珠及无菌水的三角瓶中,充分振荡10min,过滤,通过血球计数板调节孢子浓度。1.4.2毛主席准备将调节好浓度的孢子悬浮液均匀喷洒在充分蒸煮后的豆腐白坯上,置于35℃霉菌培养箱中,湿度控制在80%,培养一定时间,制得毛坯。1.4.3nacl溶液浸提液制备将毛坯充分研磨,准确称取5g,加20mL0.15mol/LNaCl溶液,在(40±0.5)℃水浴中间断搅拌,浸提1.5h。1.4.4单因素试验和前氧化条件1.4.4.蛋白酶、脂肪酶、糖化酶、-淀粉酶活力测定分别将雅致放射毛霉和米根霉孢子悬浮液浓度调节为1.0×107个/mL,两者比例(V/V)分别为3∶1,2∶1,1.5∶1,1∶1,1∶2,1∶3,培养32h后测定蛋白酶、脂肪酶、糖化酶、α-淀粉酶活力。1.4.4.蛋白酶活力测定分别将雅致放射毛霉和米根霉孢子悬浮液浓度调节为1.0×107个/mL,两者比例(V/V)调为1.5∶1,分别培养24,28,30,32,36,40h后测定蛋白酶、脂肪酶、糖化酶、α-淀粉酶活力。1.4.4.蛋白酶活力测定分别将雅致放射毛霉和米根霉孢子悬浮液浓度调节为1.0×106,5×106,1.0×107,1.5×107,2.0×107个/mL,两者比例(V/V)调为1.5∶1,分别培养32h后测定蛋白酶、脂肪酶、糖化酶、α-淀粉酶活力。1.4.4.前酵条件优化试验以菌种配比、培养时间、孢子浓度为三因素,豆腐毛坯中的蛋白酶活力、脂肪酶活力、糖化酶活力、α-淀粉酶活力及感官评分为指标,对前酵条件进行整体优化L9(33)正交试验,方案见表1。1.5测量1.5.1酶活性测定采用福林酚法,40℃,适宜的pH值条件下,一个酶活力单位(μmol/min)被定义为每分钟水解酪蛋白产生酪氨酸的酶量。1.5.2活性单位的测定采用PVA-橄榄油乳化液水解滴定法进行测定。将在40℃,pH7.5条件下,1min水解底物产生1μmoL可滴定的脂肪酸,定义为一个酶活力单位。1.5.3糖化酶活性测定采用碘量法,40℃,pH4.6条件下,每小时分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。1.5.4i-淀粉酶活性的测定采用YOO改良法,40℃,pH6.0条件下,每5min内水解1mg可溶性淀粉所需的酶量为一个酶活力单位。1.5.5注重了植物的生长毛坯的感官属性直接影响了后酵坯体甚至最终产品质量。前酵过程中菌丝的充分繁殖不但使豆腐坯表面形成一层韧而细致的皮膜,保证了后酵中豆坯块形的完整,还积累了大量的酶类,为后酵的生化变化提供了基础。为了使工艺条件优化效果达到最佳,特在前酵条件的优化试验中加入毛坯感官评定作为评价指标,评分标准见表2。2结果与分析2.1最优发酵条件的确定试验将蛋白酶、脂肪酶、糖化酶以及α-淀粉酶的酶活力作为评价指标,考察影响腐乳前酵的因素菌种配比(V/V)、培养时间(h)以及孢子浓度(个/mL),以确定最佳的发酵条件。2.1.1不同配比时织物的酶活力不同配比对酶活力的影响见图1。毛霉与根霉的配比既决定了在高温条件下毛坯的质量,也决定了毛坯的酶系组成。由图1可知,在配比为1∶2时,脂肪酶活力和α-淀粉酶活力达到最大,蛋白酶活力和糖化酶在1∶1时达到最大,但蛋白酶活力为最重要的考察指标,且配比1∶1时感官更佳。故选择菌种配比为1∶1较为适宜。2.1.2酶活力测定结果不同发酵时间对酶活力的影响见图2。由图2可知,在毛坯上糖化酶、脂肪酶和α-淀粉酶活力在36h时达到最大。而蛋白酶活力在32h时达到最大,但与36h的测定值相差不大。综合考虑各酶系的酶活力情况,选择发酵时间在为36h较合适。2.1.3糖化酶及脂肪酶活力不同孢子浓度对酶活力的影响见图3。由图3可知,当孢子浓度为1.5×107个/mL时,毛坯上糖化酶及脂肪酶活力达到最大。而蛋白酶活力及α-淀粉酶活力在孢子浓度为1.0×107个/mL时达到最大。考虑蛋白酶活力为最主要的考察指标,且孢子浓度为1.0×107个/mL时,糖化酶及脂肪酶活力与孢子浓度为1.5×107个/mL时比较相差不大。故选择孢子浓度为1.0×107个/mL为适宜点。2.2正交试验的结果2.2.1各因素对脂肪酶活力的影响按照表1因素进行正交设计,根据单因素实验结果,采用正交试验对多菌种发酵的前酵条件进行优化,结果见表3,表4。由极差分析可知,各因素对蛋白酶活力的影响大小为C>A>B,最佳组合为C3A1B1;各因素对脂肪酶活力的影响大小为A>C>B,最佳组合为A2C3B3;各因素对糖化酶活力的影响大小为C>B>A,最佳组合为C3B3A3;各因素对α-淀粉酶活力的影响大小为B>C>A,最佳组合为B3C3A1;各因素对感官评分的影响大小为C>B>A,最佳组合为C3B2A3。续表由方差分析可知,各因素对蛋白酶活力的影响大小为C>A>B;各因素对脂肪酶活力的影响大小为A>C>B;各因素对糖化酶活力的影响大小为C>B>A;各因素对α-淀粉酶活力的影响大小为B>C>A;各因素对感官评分的影响大小为C>B>A;这与极差分析的结果是一致的。2.2.2最佳方案的分析由于本试验有5个指标,因此使用综合平衡法,以便找出使每个指标都尽可能好的试验方案。2.2.2.各因素对糖化酶活力及感官评分的影响由5个指标的极差和方差分析结果可知,对蛋白酶活力、糖化酶活力及感官评分来讲,C的极差都是最大的,即孢子浓度是影响试验结果的最大因素。由以上效应曲线图可知,以取1.5×107个/mL最好。2.2.2.不同浓度的蛋白酶活力除了脂肪酶活力外,A对其他4个指标来说,极差都不是最大的,即A不是影响最大的因素。由效应曲线图可知,对蛋白酶活力和α-淀粉酶活力来说,取1∶1最好;对脂肪酶活力来说,取1.5∶1最好;对糖化酶活力来说,取2∶1最好;对感官评分,取2∶1最好。但是考虑到蛋白酶活力是最主要考察的指标,且对脂肪酶活力和感官评分指标来说,取1∶1也不是太差,对5个指标综合考虑,比例取1∶1最好。2.2.2.白酶活力指标的确定对α-淀粉酶活力来讲,B的极差最大,发酵时间是影响最大的因素,从效应曲线图可知,取36h最好。对于脂肪酶活力和糖化酶活力来说,取36h最好。而对于蛋白酶活力来说,虽然36h不是最大点,但是与最大值32h所对应的点相差值并不大。另外对于感官评分,取34h最好,但是它不是最主要的考察指标,且取36h也不是很差。对5个指标综合考虑,应取36h为好。通过各因素对各指标影响的综合分析,得出较好的试验方案是A1B3C3,在此条件下,进行三次重复验证试验,蛋白酶活力为60.89U/g干重,脂肪酶活力为5.92U/g干重,糖化酶活力为38.99U/g干重,α-淀粉酶活力为23.85U/g干重。2.2.3高温和高温对毛霉根霉组织减菌剂的影响为了使正交优化试验得出的高温下前酵最佳工艺参数更加准确可靠,特进行对照试验。其中包括在35℃高温条件和28℃常温条件下进行对照试验,结果见表5。由对照试验可知,在高温下,毛霉根霉混合发酵所得的毛坯优于此温度下毛霉单菌发酵所得毛坯。相对于常温毛霉单菌发酵所产毛坯,高温多菌种发酵所得毛坯蛋白酶活力与其相差不大,甚至其他酶系活力还略高。3最佳工艺条件的确定由本试验发现,采用毛霉、根霉混合发酵生产腐乳可以提高菌种高温耐受能力。通过正交试验优化了高温多菌种发酵腐乳前期发酵过程中菌种比例、发酵时间、接种孢子浓度,对实现腐乳常年生产有一定的现实意义。高温多菌种发酵腐乳前期发酵的最佳工艺