临床研究用人间充质干细胞质量检验规范-讨论版

21/21临床研究用人间充质干细胞质量评价规范（讨论稿）前言人间充质干细胞(humanMSCs,hMSCs)是一类具有一定的自我复制更新和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于胎儿和成人各组织中，如骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、肌腱，以及新生儿附属组织，如脐带、胎盘、羊膜等等组织。除一定程度的分化潜能外，hMSCs还具有独特的免疫调控和组织再生功能，参与调控异常免疫反应、维护免疫平衡，帮助机体形成有利于病损组织细胞修复或再生的微环境，以促进损伤组织细胞的修复或再生。hMSCs独特的生物学功能决定了其应具有广泛的临床适应症，并使其成为近十年来细胞治疗领域中发展最为广泛、最为迅速的干细胞类型。过去10年来所积累的大量临床前及临床研究数据显示，不同组织来源的hMSCs均具有不同程度，针对不同临床适应症的治疗效果。目前在登记的各种自体或异体组织来源的hMSCs临床适应症类型或疾病亚型已有上百种，其中常见的临床适应症类型包括骨关节疾病、心血管疾病、器官功能衰竭、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、多发性硬化、脊髓损伤、炎性结肠炎、脊髓侧索硬化、系统性红斑狼疮，等等。然而，无论是临床前或临床研究阶段，现有的研究结果仍都存在不同程度的问题，而所有问题又都不同程度地汇聚到hMSCs的质量问题上。其中临床前研究所表现的问题是，不同研发者所使用的hMSCs来源、培养体系、制备工艺、质量标准、评价技术等存在很大差异，也存在质量评价内容和技术的合理性等问题，因此导致不同研究者间的研究结果很难具有可比性，或结果难以重复，因此也很难形成相对统一的质量标准。而临床研究中所存在的问题是，绝大多数临床研究还处在早期阶段，所观察的病例数还很有限，临床研究中细胞质量的标准化和细胞使用的规范性仍存在巨大差异，所有这些尚不足以完全支持hMSCs的安全性和/或疗效。除此以外，因hMSCs临床前研究还远不够完善，对其临床研究的指导作用还不强，或者临床前研究与临床研究存在严重脱节现象，临床研究阶段细胞质量的稳定性研究欠缺，细胞质量评价和受试者评估体系尚未建立，等等。所有这些问题均不同程度地反映出研发者或从业者对临床研究用hMSCs质量属性的认识深度和广度，以及对相关质量的控制能力仍存在很大差异。类似于所有治疗性细胞产品，hMSCs代表着人类医药发展史上最为复杂的医药产品，具有传统医药产品难以比拟的多样性、变异性、复杂性和不稳定性等质量特性。为有效保障包括hMSCs在内的所有治疗性细胞的质量，为其标准化使用和规范化管理，就需在相应监管属性的规定下，结合hMSCs的科学性和制备工艺相关风险因素等考虑，综合全面地把握相关细胞产品的质量属性。基于这一思想，hMSCs应具备基本细胞生物学属性、微生物学安全性、生物学安全性及生物学有效性“四大类”质量属性。这“四大类”质量属性，应属于“狭义”质量要素，是质量标准、质量体系建立的对象，是临床前研发阶段首要解决的关键问题，也是整个细胞产品研发周期全质量要素的基础。以往我国由于忽视了对这一内容的完整性研究和相应综合质量体系的建立，因此在一定程度上影响了我国hMSCs临床研究的高质量发展。为使hMSCs能够持续稳定地满足临床研究的质量要求，首先需建立与其“四大类”质量属性相适应的质量体系。相关质量体系应包括以GMP原则为基础的质量保障体系，和由综合性质量评价技术和评价规范所构成的质量评价体系。其中，质量评价技术是指针对hMSCs各质量属性所建立起的、具有共识性的各类物理、化学及生物学评价技术。质量评价规范是规范在产品研发或生产制备的不同阶段，依据不同的质量控制目标，选择合理的评价技术或技术组合，以及合理的评价策略，对相关产品进行有效的质量评价，其根本目标应是提高产品研发效率和提升产品研发的管理/监管水平。就质量体系而言，首先需要建立和完善的，是保障不同组织来源hMSCs共性质量属性/质量要求的质量体系，包括与之相关的质量评价体系、评价规范。hMSCs质量评价规范的设计应是依据相关领域目前在hMSCs科学性方面的共识、不同组织来源hMSCs质量研究成果及质量控制经验，以及现阶段的管理/监管能力和需要，特别是现阶段以《干细胞临床研究管理办法（试行）》（2015）和《细胞制品研究与评价技术指导原则（试行）》（2017）为代表的“类双轨制”管理模式的需要。本文在对有关hMSCs质量研究成果、质量评价的实践经验总结，和在质量评价规范相关理论探索的基础上，综合上述各方面的考虑，提出了《临床研究用人间充质干细胞质量评价规范（讨论稿）》。本文内容涵盖了对hMSCs“四大类”质量属性/质量要求的介绍、针对“四大类”质量属性的评价内容、不同类型的质量评价规范，和质量评价规范与现行“类双轨制”管理模式的关联性。希望与hMSCs治疗研究各有关方就本文内容进行深入讨论，使其最终成为服务于我国hMSCs制剂/制品研发在质量评价规范上的共识，以便更好地指导和支撑我国hMSCs“临床研究”备案申报和/或“临床试验”注册审评工作。一、hMSCs的质量属性和质量要求不同组织来源、符合临床研究基本监管属性的hMSCs，应具备“四大类”质量属性，即基本细胞生物学属性、微生物学安全性、生物学安全性和生物学有效性。这“四大类”质量属性也是临床研究用hMSCs的‘四大类’质量要求。hMSCs的基本细胞生物学属性不同组织来源的hMSCs基本细胞生物学属性应包括细胞鉴别、活性、纯度和均一性等。细胞鉴别的质量属性是由相关细胞的形态学、遗传学、代谢谱学、分子标志物（或标志物群）表达特征，以及独特的生物学功能等属性构成。细胞活性是由细胞活率、增殖周期、倍增时间、克隆形成率、端粒酶活性（和/或端粒长度）等生物学特征综合体现；细胞纯度和均一性是指在细胞制备过程中所引入的非相关细胞，以及相同来源、相同细胞类型和相同代次或相同级别的细胞（如同一级细胞库的细胞）在生物学特性方面的纯度和均一性。hMSCs的微生物学安全性hMSCs的微生物学安全性，是指相关细胞需满足无细菌、真菌、支原体、病毒污染，以及无微生物代谢产物污染的质量要求。其中，病毒污染是指来源于供者或是制备工艺所引入的种属特异病毒（如人源病毒和动物源性病毒）、内外源性逆转录病毒，以及所有非特定病毒因子。微生物代谢产物是以革兰氏阴性菌所产生的内毒素为代表。为确保hMSCs微生物学安全性，除需建立细胞供者筛选标准、建立基于cGMP原则的质量保障体系外，还需设立基于各种评价规范的过程控制及终产品质量控制，并通过体外细胞模型、敏感动物接种及鸡胚接种等方法，对潜在污染的微生物及其代谢产物进行有效评价。hMSCs的生物学安全性hMSCs的生物学安全性质量属性是指其细胞内在的、由其生物学特性所决定的，和外在的、诱发其生物学特性发生改变相关的安全性问题。通过对hMSCs生物学安全性评价，希望能预测或排除hMSCs进入体后所产生的成瘤性和/或促瘤性、异常免疫反应、异常分化、异位迁移或异位停留等生物学安全性问题。在对hMSCs生物学安全性进行评价时，应尽可能考虑相关细胞的临床适应症、给药途径、剂量等与临床治疗直接相关的因素，并利用合适的体内、体外试验模型对相关的生物学安全性进行有效评估。hMSCs生物学有效性hMSCs生物学有效性质量属性，是指与其临床治疗效应密切相关的各种生物学特性或机制的总和，是临床前研究阶段用于预测hMSCs临床治疗效应的重要质量要求。不同组织来源的hMSCs生物学有效性质量属性，可归类为诱导分化功能、免疫调控能力及组织再生功能。其中，诱导分化功能主要是指在体外特定诱导分化条件下，相关细胞向目的细胞分化的能力。目前用于评价hMSCs诱导分化功能的目的细胞分化，包括成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞分化。免疫调控功能是指hMSCs释放免疫调控分子、抑制促炎性免疫细胞增殖或活性、促进调节性免疫细胞增殖或极化的功能。组织再生功能是指不同组织来源的hMSCs所具有的保护组织细胞抗凋亡损伤、促进病损组织血管再生、刺激病损组织内源性干细胞增殖和分化等功能。对hMSCs生物学有效性进行评价，需结合体外细胞模型和体内动物模型进行综合评价。在使用动物模型时，应尽可能地在临床适应症、给药途径、剂量等与临床治疗直接相关因素充分考虑的基础上，对相关细胞生物学有效性进行评价。二、hMSCs的质量评价内容 在对具体hMSCs制剂/制品进行质量评价时，可根据其生物学特性、制备工艺、风险因素、管理目标和管理模式的要求，选择合理的评价内容和评价技术，以特定的质量价规范（见后述）对其进行质量评价。2.1.hMSCs基本细胞生物学属性的评价内容2.1.1.细胞形态光学显微镜下的细胞形态2.1.2.个体遗传多态性或遗传指纹图谱-STR（短串联重复序列，shorttandemrepeats）图谱。用于评价相关细胞的独立个体来源、纯度和可能与其它人源细胞间的交叉污染。2.1.3.细胞表面标志物的检测包括对hMSCs阳性表面标志物群（如CD73,CD90,CD105,CD44,CD166，其阳性率应不低于95%），和阴性表面标志物群（如CD11b或CD14、CD19或CD79a、CD34、CD45和HLA-DR，其阳性率应不高于2%）进行检测。2.1.4.种属间细胞污染的检测可利用同工酶谱分析或种属遗传多态性基因分析-基于细胞色素b基因多态性的核酸扩增分析，对相关细胞的种属特征和种属间不同细胞交叉污染进行评价。2.1.5.细胞活性通过对细胞活率、群体倍增时间、克隆形成率、细胞周期等对细胞活性进行综合评价。2.1.6.中期染色体核型分析正常染色体核型应为46XX或者46XY，无缺失、重复、倒位、易位等结构异常。2.2.hMSCs微生物学安全性评价内容hMSCs微生物学安全性检测应包括对细菌、真菌、支原体、各类病毒等进行相关病原物（如核酸、蛋白、多糖）或微生物代谢物的可直接检测，也可利用细胞模型或动物模型，对相关微生物的存在和效应进行间接分析。2.2.1.无菌检测-细菌、真菌检测确证性无菌检测应按照现行版药典所要求的培养法进行检测，还可采用全自动细菌/分枝杆菌检测系统进行无菌检测。另外，还可进行革兰氏染色法镜检，或针对病原物的核酸或特定代谢物进行快速放行检验。可依据工艺阶段、管理需要、临床应用需要等，采用不同时间针对不同工艺阶段的细胞，选择不同检测方法。2.2.2.支原体检测需依据药典中规定的培养法和指示细胞感染法（或称DNA染色法）相结合进行确证性支原体检测。也可应用支原体核酸扩增方法作为快速放行方法。需根据不同的评价规范，针对不同工艺阶段的细胞采取确证方法和放行方法相结合的支原体检测。2.2.3.特定病毒和非特定病毒检测人源特定病毒包括HIV-1/2、HTLV、HBV、HCV、CMV、EBV、人细小病毒B19、多种亚型的人乳头瘤病毒（HPV）、人疱疹病毒（HHV）等。相关检测以病原体核酸检测为主，使用国家批准的体外诊断试剂盒进行检测。牛源病毒的检测，包括牛副流感病毒、牛腺病毒、牛细小病毒、牛腹泻病毒和弧肠孤病毒等。猪源病毒的检测，包括猪细小病毒、猪细环病毒以及猪圆环病毒等。逆转录病毒检测，可依次包括逆转录酶活性检测（PERT或PBRT法）、透射电镜观察可能存在的病毒颗粒，以及利用特定敏感细胞对病毒感染力进行检测。非特定病毒（或非特定致病因子）检测，包括直接细胞培养法观察其对异体动物的血吸附性和血凝集效应，通过易感细胞体外接种方法（如三种细胞传达接种法）对可能的细胞病变效应、血吸附和凝集效应进行评价，和选择易感动物接种对可能的组织病变效应进行广谱性筛查。2.2.4.细菌内毒素检测应使用现行版药典所建议的凝胶法和光度测定法，以及改良的凝胶法，也称重组C因子法，用重组C因子代替传统凝胶法中所使用的鲎试剂以减少假阳性。2.3.生物学安全性评价内容hMSCs生物学安全性包括成瘤性和促瘤性、异常免疫反应、异常分化等。在生物学安全性评价中还应包含对制备工艺中使用的部分添加物、动物源性血清、辅料等残留物进行检测。2.3.1成瘤性和促瘤性检测成瘤性检测是评价所检测细胞在免疫缺陷动物体内形成肿瘤的能力。除动物试验外，也可通过体外软琼脂克隆形成试验、端粒酶活性检测，对受检细胞的成瘤性风险进行间接评估。促瘤性检测是基于hMSCs的免疫抑制功能，可能形成有利于体内已存在的肿瘤细胞生长或进一步恶化的微环境而设计的检测内容。促瘤性的检测可通过hMSCs与具有成瘤性的、不同性质的（如实体瘤和血液肿瘤）的人源肿瘤细胞，同时或先后接种在同一免疫缺陷动物的不同部位，以观察hMSCs对具有成瘤性的肿瘤细胞的生长和转移的促进作用。2.3.2异常免疫反应异常免疫反应的检测包括对hMSCs细胞自身免疫相容抗原HLAs分子、免疫共刺激分子、促炎因子等的表达进行检测，和hMSCs对异体免疫细胞的增殖/活化（如总淋巴细胞增殖）的检测，以及对活化的免疫细胞相关促炎因子（如IFN,TNF）释放效应的检测。2.3.4残留物的检测hMSCs制备过程中特殊的培养基成分、添加成分或制备工艺中残存的杂质，如牛血清蛋白、胰酶、抗生素、DMSO、特定细胞因子等，应在制剂/制品中予以清除，并在质量评价中对相关残留进行检测。2.4.生物学有效性的评价内容2.4.1多向分化功能的评价内容对不同组织来源的hMSCs多向分化功能评价，应包括成骨细胞、成脂细胞、成软骨细胞分化功能的评价，其中可以成骨细胞分化作为代表性评价内容。此外，可根据临床适应症的不同，选择适应症相关的目标分化细胞（如肝上皮细胞、神经细胞、胰岛细胞等）的分化功能进行评价。2.4.2.免疫调控功能的评价内容hMSCs的免疫调控功能表现为抑制促炎性免疫细胞增殖活化、抑制免疫细胞释放炎症因子，和促进调节性免疫细胞增殖或极化，以及hMSCs细胞自身分泌不同类型免疫调控因子的能力。具体评价内容可包括hMSCs抑制活化后的（异体）淋巴细胞增殖、抑制促炎的Th1/Th17淋巴细胞增殖，和促进调节性Treg淋巴细胞增殖或极化；hMSCs抑制活化的免疫细胞释放炎症因子（如对TNF-α、IFN-γ、IL-17A等促炎因子释放的抑制）；hMSCs在静息状态下分泌PGE2等调控因子，和在炎性因子（如IFN）激活的情况下分泌IDO1等因子进行评价。2.4.3.hMSCs组织再生功能的评价内容对hMSCs促进病损组织细胞再生功能的评价包括其保护组织细胞抗凋亡损伤、促进新生血管形成、促进巨噬细胞从M0/M1型向M2型极化，促进病损组织内源性干细胞或前体细胞增殖和分化，或促进已分化的组织细胞发生跨系分化(trans-differentiation)，以及hMSCs细胞自身可分泌不同类型的生长因子促进组织损伤修复或再生。具有促进组织再生功能的生长因子包括肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、胰岛素样生长因子-1(insulinlikegrowthfactor,IGF-1)、神经营养因子(glialcelll-derivedneurotrophicfactor,GDNF，和brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)等。三、hMSCs的质量评价规范 hMSCs质量评价规范是其质量评价体系的重要组成部分，是在hMSCs产品研发的不同阶段，针对不同阶段的细胞，选择不同的质量评价内容和相应评价技术，以满足不同质量控制目标和管理目标所构成的各类质量评价方式。3.1hMSCs质量评价规范制定的依据hMSCs质量评价规范的总体依据是其科学性、制备工艺、风险因素分析、质量控制目标和与之相对应的管理或监管目标，以及评价策略。hMSCs的基本制备工艺包括，组织获取-获得细胞（经酶消化和/或机械处理）-培养扩增-消化传代-建立细胞库（包括主细胞库、工作细胞库）-复苏扩增-制剂制备。这一过程整体上只包括组织细胞获取、培养扩增、冻存复苏等基础性细胞操作技术，其中的每一阶段都可能引入不同类型微生物安全性风险。其中，源自供者的微生物是第一重要微生物污染源。在基础制备工艺的不同阶段，可对相应的细胞进行特殊的物理、化学或生物学处理以提高细胞治疗效应。生物学处理主要包括对hMSCs的基因修饰。然而，不同类型、不同程度的特殊处理，可能对细胞其他质量属性，特别是对其生物学安全性产生严重影响。因此，需通过对特殊处理相关的制备工艺和相关风险进行分析，确定特殊处理相关联的质量属性，并设计合理的质量评价规范对特殊处理细胞进行综合有效的质量评价。质量评价规范涉及细胞的批次、代次、阶段形态等关键因素。细胞批次包括来源批次和生产制备批次。其中，同一来源批次是指由同一供体、同一组织、同一时间、使用同一工艺采集、分离并最终获得的hMSCs。而生产制备批次是指基于同一组织来源批次，经后续的工艺过程所制备的细胞制剂。如在不同时间由相同级别细胞库所制备的hMSCs制剂为不同制备批次的细胞。细胞代次包括使用代次和扩展代次，使用代次是指临床治疗用的细胞代次，扩展代次是指在使用代次基础上不同程度的扩增代次。对数量多和/或扩增能力强的细胞，应鼓励建立多级细胞库，以保障在相同工艺阶段的不同细胞具备质量的均一性，和保障临床应用过程中相同质量细胞数量的充足性。各级细胞库的细胞应是作为中间细胞形态质量评价的重要内容。终末细胞制剂是指最终工艺阶段所制备的细胞，特别是来自于工作库的细胞，经与辅料混合所形成的可直接应用于受试者的细胞形态，或经与辅料混合再冻存后，并可随时复苏直接使用的细胞形态。评价策略的目的是保障合理质量属性的覆盖率，同时，提高评价效率、降低评价成本。如质量评价中涉及同一组织来源批次的不同代次或不同阶段的细胞，需尽量减少细胞的使用量和减少相同评价项目在不同评价对象中的重复性。对建立不同类型hMSCs质量评价规范的考虑在建立hMSCs质量评价规范时，首先应建立满足hMSCs综合质量要求、保障其制备工艺的质量和稳定性所需的质量评价规范，即“质量检验”。这一评价规范是由《干细胞制剂质量控制和临床前研究指导原则（试行）》（2015）所规定的，用于“临床研究”备案申报所需的综合质量评价规范。“质量检验”是以一定数量（来源）批次的终末制剂为评价对象，针对“四大类”质量属性，在质量控制技术选择上以确证性评价技术为主的评价规范。在“质量检验”的基础上，可建立针对不同阶段关键制备工艺的过程控制，和针对不同组织来源批次及生产制备批次的中间细胞形态和终末制剂标准放行的评价规范，即“放行检验”。同时，为借助第三方评价机构验证和强化自身研发能力，或为满足不同管理/监管需求，可在“质量检验”和“放行检验”的基础上，建立不同形式的“复核检验”评价规范。这种“质量检验”-“放行检验”-“复核检验”体系，和在这一体系下所衍生出的其他类型的评价规范，理论上可满足不同质量目标和管理目标所需的质量要求。在建立和实践hMSCs评价体系、评价规范时，需充分考虑所有hMSCs制剂/制品中共性的和具体制剂/制品的特殊性质量要求，首先需满足同性质量评价要求。hMSCs“质量检验”中共性的评价内容，包括细胞表面标志物分析、活性、STR图谱分析、种属鉴别和种属间细胞交叉污染、染色体核型分析、细菌/真菌/支原体/病毒、内毒素、成瘤性、异常免疫反应、牛血清残留、多向分化潜能（以成骨、成脂和成软骨细胞诱导分化为主）、免疫调控功能（包括对淋巴细胞增殖抑制、对Th1/Th17/Treg淋巴细胞亚群的调控，和抑制TNF释放），等等。在共性质量要求和质量评价的基础上，每一hMSCs制剂的研发者还应根据其制剂制备工艺的特殊性和临床适应症的特殊性，开展相关质量研究和建立针对特殊性质量属性的质量控制技术。其中，基因修饰工艺可能对hMSCs自身的生物学特性影响较大，工艺中所使用的质粒DNA、病毒等都可能部分地改变宿主细胞基因组结构和稳定性，进而可能导致多种潜在的hMSCs生物学安全性问题，质粒DNA和病毒残留对受试者也可能形成潜在安全性隐患。因此，应对特殊制备工艺，特别是基因修饰对细胞质量属性的影响进行深入研究，并建立有效的评价技术和合理的评价规范对其进行有效控制。同时，还应对特殊工艺处理所预期达到的新的生物学有效性质量属性、稳定性，和对其他生物学有效性的影响进行验证和评价。3.3“通用型”hMSCs的“质量检验”“通用型”hMSCs是指在整个制备工艺过程中，只是通过常规组织获取、细胞分离、培养、扩增、冻存、复苏等基本操作所获得，未经任何特殊处理，并具有hMSCs基本的生物学有效性和多种临床适应症治疗潜能的hMSCs细胞。具体评价内容可参考表1的内容。表1.完整版“通用型”hMSCs“质量检验”的内容。P5，P5+X，P5+X+Y分别代表初始检测代次（或临床使用代次）、初始代次后的X个扩展代次（如5个代次）、初始代次的X+Y个（Y也可以为5个代次）。★为需要检测项。检测项目相同组织来源批次细胞P5P5+XP5+X+Y1．细胞鉴别1.1细胞形态★★★1.2同工酶法★★1.3STR图谱鉴别★★1.4流式细胞仪检测细胞表面标记物★★★1.5种属间细胞污染检测★★1.6染色体核型检测★2．细菌、真菌检测★★★3．支原体检测3.1培养法★★★3.2DNA荧光染色★★★4．细胞内、外病毒因子检测 4.1细胞培养直接观察法★★★4.2体外不同传代细胞培养及血吸附/血凝试验★★4.3动物体内接种法1）乳鼠脑内及腹腔接种★★2）小鼠脑内及腹腔接种★★3）豚鼠腹腔接种★★4）家兔皮内及皮下接种★★4.4鸡胚接种检测1）鸡胚卵黄囊腔接种★★2）鸡胚尿囊腔接种及尿囊液血凝试验★★4.5特殊人源病毒检测HIV/HBV/HCV/HCMV/EBV/HPV/HHV检测★4.6牛源病毒检测★4.7猪细小病毒检测★4.8逆转录病毒检测★★5.免疫学反应检测5.1淋巴细胞增殖抑制检测★★★5.2特定淋巴细胞亚群检测(Th1\Th17\Treg)★★★5.3淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验★★★6.生物学有效性评价6.1成骨细胞分化★★★6.2成软骨细胞分化★★★6.3成脂细胞分化★★★7.细胞活性检测7.1细胞数和细胞存活率★★★7.2细胞生长曲线★★7.3细胞周期测定★★8.成瘤性检测8.1裸鼠体内接种试验-★8.2软琼脂克隆形成试验★8.3端粒酶活性检测★★9.残留物检测9.1.牛血清白蛋白残留检测★9.2.抗生素残留检测★可将表1的内容视为可服务于两种管理模式的“完整版”评价内容。也可以设计一种单纯满足“临床研究”备案需要的“精简版”“质量检验”。所建议的“精简版”评价内容可参见表2。需要强调的是，“精简版”评价内容的选择，必须基于对hMSCs科学性的深刻认识以及持续质量研究成果的总结，和对完成管理目标和提高管理效率的充分认识。表2.精简版“通用型”hMSCs“质量检验”的内容。P5和P5+X分别代表初始检测代次（或临床使用代次）、初始代次后的X个扩展代次（如5个代次）。★：为需要检测项。检测项目相同组织来源批次细胞P5P5+X1．细胞鉴别1.1细胞形态★★1.2STR图谱鉴别★★1.3流式细胞仪检测细胞表面标记物★★1.4种属间细胞污染检测★★2．细菌、真菌检测★★3．支原体检测3.1培养法★★3.2DNA荧光染色★★4．细胞内、外病毒因子检测 4.1细胞培养直接观察法★★4.2体外不同传代细胞培养及血吸附/血凝试验★★4.3乳鼠脑内及腹腔接种★4.4鸡胚接种检测1）鸡胚卵黄囊腔接种★2）鸡胚尿囊腔接种及尿囊液血凝试验★4.5特殊人源病毒检测HIV/HBV/HCV/HCMV/EBV/HBV/HHV检查★4.6牛源病毒检测★4.7猪细小病毒检测★4.8逆转录病毒检测★5.免疫学反应检测5.1淋巴细胞增殖抑制检测★★5.2特定淋巴细胞亚群检测(Th1\Th17\Treg)★★5.3淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验★★6.生物学有效性评价6.1成骨细胞分化★★6.2成脂细胞分化★★7.细胞活性检测7.1细胞数和细胞存活率★★7.2细胞生长曲线★7.3细胞周期测定★8.成瘤性检测8.2软琼脂克隆形成试验★8.3端粒酶活性检测★★9.残留物检测9.1.牛血清白蛋白残留检测★9.2.抗生素残留检测★3.4“通用型”hMSCs的“放行检验”在以工艺验证为目的的‘质量检验’基础上，hMSCs制剂的研发者应根据其制剂工艺的特点，和不同阶段细胞质量的关联性，设计用于不同关键制备工艺阶段质量控制和产品放行的“放行检验”评价规范。对于建有细胞库的hMSCs，其关键制备工艺应包括各细胞库的制备，种子细胞制备、主细胞库和工作细胞库制备，以及制剂制备，并依据不同阶段质量要求的关联性，设计各关键工艺阶段的“放行检验”。3.4.1.hMSCs细胞库的“放行检验”内容待完善3.4.2.hMSCs制剂的“放行检验”内容待完善四、hMSCs质量评价规范与干细胞“类双轨制”管理模式的关联性内容待完善致谢感谢中国食品药品检定研究院细胞资源保藏研究中心研究人员：纳涛、张可华、韩晓燕、张丽霞、吴婷婷、陈平、王盼、闫占海、李欣、牟春琳、李学家、赵楠等同志在本研究工作中的贡献。感谢国家重点研发计划(2016YFA0101501)和中国科学院干细胞与再生医学研究战略性先导科技专项(XDA-01030508，XDA01030506)对本研究工作的支持。参考文献[1] 国家药典委员会,中华人民共和国药典2015年版,中国医药科技出版社,北京,2015.[2] 干细胞临床研究管理办法（试行）中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局,2015.[3] 干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）,国家食品药品监督管理总局,2015.[4] 细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）,国家食品药品监督管理总局,2016.[5] ISSCR,Guidelinesforstemcellresearchandclinicaltranslation,(2016).[6] FDA,GuidanceforIndustry—CurrentGoodTissuePractice(CGTP)andAdditionalRequirementsforManufacturesofHumanCells,Tissues,andCellularandTissue-BasedProducts(HCT/Ps),(2009).[7] E.P.Commission,EuropeanPharmacopeia.Method5.2.3-CellSubstratesfortheProductionofVaccinesforHumanUse.,(2010).[8] U.N.Formulary,USPharmacopeia.CellularandTissue-BasedProducts.GeneralChapter1046,(2012).[9] FDA,Guidance—PotencyTestsforCellularandGeneTherapy,(2011).[10] M.Dominici,K.LeBlanc,I.Mueller,I.Slaper-Cortenbach,F.Marini,D.Krause,R.Deans,A.Keating,D.Prockop,E.Horwitz,Minimalcriteriafordefiningmultipotentmesenchymalstromalcells.TheInternationalSocietyforCellularTherapypositionstatement,Cytotherapy8(2006)315-317.[11] M.Krampera,J.Galipeau,Y.Shi,K.Tarte,L.Sensebe,Immunologicalcharacterizationofmultipotentmesenchymalstromalcells--TheInternationalSocietyforCellularTherapy(ISCT)workingproposal,Cytotherapy15(2013)1054-1061.[12] B.Z.Yuan,EstablishingaQualityControlSystemforStemCell-BasedMedicinalProductsinChina,Tissueengineering.PartA21(2015)2783-2790.[13] B.Z.Yuan,J.Wang,Theregulatorysciencesforstemcell-basedmedicinalproducts,Frontiersofmedicine8(2014)190-200.[14] 袁宝珠,干细胞的“法规-监管-指导原则”体系,生命科学28(2016)8.[15] 袁宝珠,治疗性干细胞产品的相关风险因素,中国生物制品学杂志26(2013)736-739.[16] 韩晓燕,纳涛,张可华,袁宝珠,人间充质干细胞生物学有效性的质量评价,中国新药杂志27(2018)8.[17] 张可华,纳涛,韩晓燕,袁宝珠,基于免疫调控功能的间充质干细胞生物学有效性质量评价策略,中国新药杂志25(2016)8.[18] C.E.Goldring,P.A.Duffy,N.Benvenisty,P.W.Andrews,U.Ben-David,R.Eakins,N.French,N.A.Hanley,L.Kelly,N.R.Kitteringham,J.Kurth,D.Ladenheim,H.Laverty,J.McBlane,G.Narayanan,S.Patel,J.Reinhardt,A.Rossi,M.Sharpe,B.K.Park,Assessingthesafetyofstemcelltherapeutics,Cellstemcell8(2011)618-628.[19] A.Trounson,C.McDonald,StemCellTherapiesinClinicalTrials:ProgressandChallenges,Cellstemcell17(2015)11-22.[20] P.Galvez,B.Clares,M.Bermejo,A.Hmadcha,B.Soria,Standardrequirementofamicrobiologicalqualitycontrolprogramforthemanufactureofhumanmesenchymalstemcellsforclinicaluse,Stemcellsanddevelopment23(2014)1074-1083.[21] J.Galipeau,M.Krampera,J.Barrett,F.Dazzi,R.J.Deans,J.DeBruijn,M.Dominici,W.E.Fibbe,A.P.Gee,J.M.Gimble,P.Hematti,M.B.Koh,K.LeBlanc,I.Martin,I.K.McNiece,M.Mendicino,S.Oh,L.Ortiz,D.G.Phinney,V.Planat,Y.Shi,D.F.Stroncek,S.Viswanathan,D.J.Weiss,L.Sensebe,InternationalSocietyforCellularTherapyperspectiveonimmunefunctionalassaysformesenchymalstromalcellsaspotencyreleasecriterionforadvancedphaseclinicaltrials,Cytotherapy18(2016)151-159.[22] M.Mendicino,A.M.Bailey,K.Wonnacott,R.K.Puri,S.R.Bauer,MSC-basedproductcharacterizationforclinicaltrials:anFDAperspective,Cellstemcell14(2014)141-145.[23] C.deWolf,M.vandeBovenkamp,M.Hoefnagel,Regulatoryperspectiveoninvitropotencyassaysforhumanmesenchymalstromalcellsusedinimmunotherapy,Cytotherapy19(2017)784-797.[24] M.L.Torre,E.Lucarelli,S.Guidi,M.Ferrari,G.Alessandri,L.DeGirolamo,A.Pessina,I.Ferrero,Exvivoexpandedmesenchymalstromalcellminimalqualityrequirementsforclinicalapplication,Stemcellsanddevelopment24(2015)677-685.[25] 袁宝珠,中国干细胞临床研究、监管体系的现状及“十三五”期间的战略考虑.《再生医学：转化与应用》（主编：付小兵、王正国、吴祖泽）,2017.[26] 袁宝珠，第二十五章：干细胞产品的质量控制.《生物技术药物研究开发和质量控制》（第三版）（主编:王军志）,2018,科学出版社,962-89.[27] 樊金萍,袁宝珠.用于鉴别猴源细胞及其交叉污染短串联重复序列图谱分析方法的建立.中国生物制品学杂志,2018.31(8):874-81.名词解释人间充质干细胞(Humanmesenchymalstemcells，hMSCs)人间充质干细胞是一类存在于成人、胎儿各组织及胎儿附属组织中的具有一定程度的自我更新能力、分化潜能、独特的免疫调控功能和组织再生功能的成体干细胞，具有广泛的临床应用价值。干细胞质量属性(Qualityattributes)干细胞的质量属性是决定干细胞产品临床应用的安全性和有效性的所有质量要素的总和，其内容是由干细胞的科学属性和干细胞产品整个制备过程中所涉及的各种风险因素综合考虑而确定的。干细胞质量属性可归纳为基本生物学属性、微生物学安全性、生物学安全性和生物学有效性。基本生物学属性(Generalbiologicalattributes)也称基本细胞生物学属性，是指干细胞基本细胞生物学特性中，与细胞质量密切相关的各质量属性的总和，用于综合准确反映相关细胞的鉴别、活性、纯度和均一性等质量属性。微生物学安全性(Microbiologysafety)干细胞的微生物学安全性是指所有干细胞产品都应满足无菌（真菌及细菌）、支原体、病毒及相关微生物代谢产物污染的质量要求。生物学安全性(Biologicalsafety)干细胞生物学安全性是指由干细胞生物学特性所决定的风险因素所引起的安全性问题，相关生物学特性可能导致干细胞进入受试者体内可产生成瘤性、促瘤性、异常免疫反应、异常分化、异位迁移或异位停留等生物学安全性问题。生物学有效性(Biologicaleffectiveness)干细胞生物学有效性是临床前研究阶段所表现出的，与其临床治疗效应密切相关的各种生物学特性的总和，是在临床前研究阶段用于预测干细胞临床治疗效应的重要质量属性。细胞鉴别(Identification)是指细胞的形态学、生物化学、遗传学（包括个体遗传学、种属遗传学）、表面标志物、特定基因表达，以及特定生物学功能等细胞特性的总和。对细胞鉴别特性进行评价，可用于鉴别细胞的个体来源、种属间细胞交叉污染或同种属间非相关细胞的交叉污染、细胞纯度和均一性等质量属性。分化能力(Differentiationpotential)分化能力主要是指在体外特定诱导分化培养条件下，细胞向多种预设目标细胞分化的功能。不同组织来源的人间充质干细胞具有向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等中胚层细胞，以及肝细胞、神经细胞等其他胚层细胞分化的能力。间充质干细胞免疫调控功能(Immunomodulatoryactivities)间充质干细胞免疫调控功能主要是指在体外评价体系中所表现出的，对由不同刺激所激活的免疫反应的抑制能力，如对促炎性的免疫细胞增殖或活性的抑制能力，和对抑制性免疫细胞或调节性免疫细胞增殖或极化的促进能力，以及自身可释放不同类型免疫调节分子的能力。这些免疫调控功能也是间充质干细胞治疗各类临床适应症的关键细胞生物学机制。间充质干细胞组织再生功能(Regenerativeactivities)是指不同组织来源的间充质干细胞所具有的保护组织细胞抗凋亡功能、促进病损组织血管再生功能、刺激促炎性的巨噬细胞向抑制炎性的巨噬细胞极化，刺激病损周边正常组织细胞代偿性增殖或反分化，以及促进内源性病损组织中的干细胞增殖和分化等所有生物学功能的总和，其综合结果是促进病损组织修复甚或组织再生。成瘤性(Tumorigenicity)细胞接种到免疫缺陷动物体内后在注射部位和（或）转移部位由接种细胞所形成肿瘤的能力。质量检验(QualityTest)是《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》中所规定的，为确保干细胞治疗的安全性、有效性和质量可控性，以多个不同来源批次的干细胞制剂为评价对象，以完整的质量属性为评价对象，以制备工艺的质量及稳定性为评价目标所进行的全面质量评价方式或评价规范。放行检验(Releasetest)是在完成整个细胞制备工艺验证的基础上，根据各阶段工艺的特性和特定阶段细胞的质量要求，选择具有代表性的质量属性作为评价内容，以特定生产工艺阶段的细胞为评价对象，以具有替代性的评价技术为主所进行质量评价方式或评价规范。干细胞放行检验应包括对中间细胞（如不同级别细胞库的细胞）和终末细胞制剂的放行检验。批次(Batch)是细胞质量控制中的重要概念，可分为来源批次和生产工艺批。其中，成体干细胞的来源批次是指由同一供体、同一组织来源、在同一时间、使用同一工艺采集和分离或建立的细胞。而生产工艺批次是指由同一来源批次，经同一制备工艺所产生的细胞为同一工艺制备批次。例如，由同一工作库细胞在同一时间所制备的终末制剂为同一制备工艺批次的细胞。对于hESCs，同一来源批次是指由同一供者胚胎所分离和建立的独一干细胞系，而同一制备批次是指由同一hESCs“种子细胞”在同一时间经同一诱导分化技术所产生的终末分化细胞制剂为同一制备批次细胞。代次(Passagenumber)细胞按照规定的时间间隔和细胞比例进行常规的酶消化传代，每传代一次视为一个细胞代次。干细胞制剂(Stemcell-basedmedicinalproducts)是指经完整制备工艺所形成的，与不同成分的辅料相混合并分装至特定容器，符合特定放行标准，可直接应用于临床受试者的干细胞产品。中间细胞产品(Intermediatecellproducts)广义而言，中间产品是指从最初细胞采集到形成制剂之间的各种细胞。而实际中的中间产品多是指与关键制备工艺相对应的细胞形态，如主细胞库细胞、工作细胞库细胞等。细胞库(Cellbank)