农学动物生物化学课件13 DNA的生物合成-复制

第13章DNA的生物合成

—复制（Replication）第13章DNA的生物合成1本章主要内容：

中心法则

DNA复制的半保留性参与DNA复制的酶类和蛋白因子

DNA的复制过程

DNA的损伤和修复

反转录本章主要内容： DNA复制的半保留性DNA的复制过程2

现代生物化学和分子生物学的一个最基本的观点--在生命有机体中，基因是唯一能够复制，并且能永远存在的单位，而其意义最终须通过蛋白质才体现出来。从DNA到蛋白质，遗传信息的流动遵循着中心法则。1.中心法则 现代生物化学和分子生物学的一个最基本的观点--从DNA到蛋32.DNA的半保留复制半保留复制(semiconservativereplication)： 复制时，亲代的双链DNA解开成两条单链，然后各自作为模板指导合成新的互补链。

所形成的两个子代DNA分子与亲代DNA分子碱基顺序完全相同—复制。每个子代DNA分子中的一条链来自亲代，另一条链为新合成的—半保留。2.DNA的半保留复制半保留复制(semiconserva42.DNA的半保留复制半保留复制实验依据1958年M.Messelson等用实验加以证实双螺旋结构是半保留复制的分子基础2.DNA的半保留复制半保留复制实验依据1958年M.Me5半保留复制的意义复制的这种方式可保证亲代的遗传特征完整无误的传递给子代，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义复制的这种方式可保证亲6复制DNA的生物合成逆转录复制（replication）：即DNA的生物合成，以亲代DNA为模板合成两个完全相同的子代DNA分子的过程。复制DNA的生物合成逆转录复制（replication）：即7复制的反应

dATPdCTPdGTP dTTPDNA聚合酶

DNA模板DNA+（

n1+n2+n3+n4)PPiPPi随即被焦磷酸酶水解，从而推动聚合反应的进行。

DNA复制是在酶的催化下的脱氧核苷酸聚合 过程。需要4种dNTP为底物外，还需要多种酶、 蛋白因子、亲代DNA单链模板及RNA引物。复制的反应dCTPDNA聚合酶DNA+（PPi随即被焦磷酸83.DNA的复制过程3.1与复制有关的酶和因子

原核生物：以大肠杆菌为例1.原料：4种dNTP2.解开成单链的DNA模板3.引物（primer），小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游离的3’-OH。4.引物酶（primase，DnaG），用于合成复制所必需的RNA引物3.DNA的复制过程3.1与复制有关的酶和因子1.原95.DnaA蛋白，与复制起始部位上（OriC）特定的序列结合。E.Coli上固定的复制起始点称为Ori.C5.DnaA蛋白，与复制起始部位上（OriC）特定的序106.DnaB（解螺旋酶helicase，rep蛋白）：由多种蛋白因子协助在复制的起始点上解开双螺旋。7.单链结合蛋白（SSB，singlestrandedbindingprotein）：稳定已经解开成两股的DNA单链，防止其退火复性。6.DnaB（解螺旋酶helicase，rep蛋118.拓扑异构酶（DNAtopoisomerase）拓扑一词的含义是指物体或图象做弹性移位而又保持物体不变的性质。DNA分子中存在打结，缠绕、连环的现象。拓扑异构酶可松弛正超螺旋，还可引入负超螺旋，有利于复制叉的行进及DNA的合成。I型酶II型酶8.拓扑异构酶（DNAtopoisomerase）拓扑一词12DNA拓扑异构酶（DNAtopoiSOmerase）108局部解链后DNA拓扑异构酶（DNAtopoiSOmerase）108局139.DNA聚合酶（DNApolymerase）全称：依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase,DNA-pol或DDDP）DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ原核生物的DNA聚合酶：9.DNA聚合酶（DNApolymerase）全称：依赖14聚合酶I：用于切除引物RNA,并填补留下的空隙5’→3’

聚合酶活性，延伸多核苷酸链3’→5’

外切酶的作用，切除可能错配的核苷酸5’→3’外切酶的作用是切除引物聚合酶I：用于切除引物RNA,并填补留下的空隙5’→3’15小片段

323个氨基酸5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸

DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶小片段 323个氨基酸大片段/Klenow片段 60416聚合酶II：活性弱5’→3’聚合酶活性，延伸多核苷酸链3’→5’核酸外切酶活性聚合酶III：主要的复制酶，并有校读、纠错的功能

5’→3’聚合酶活性，延伸多核苷酸链，活性很强，有模板依赖性，其延伸的方式是依据碱基互补配对的原则，将原料dNTP与游离的3’-OH上连接，同时释出一个PPi。

3’→5’核酸外切酶活性，切除可能错配的核苷酸聚合酶II：活性弱5’→3’聚合酶活性，延伸多核苷酸链聚17DNA-polIII:

由10种亚基组成的不对称聚合体

催化效率最高其中α亚基具有5'→3'聚合DNA的酶活性，因而具有复制DNA的功能；而ε亚基具有3'→5'外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。φεεDNA-polIII:由10种亚基组成的不对称聚合体18[农学]动物生物化学课件13DNA的生物合成—复制19负责链的延长

(活性高)＋＋

切去引物物RNA，补上 正确的的DNA片段与修复有关(活性低)＋＋＋＋＋DNA聚合 酶ⅠDNA聚合 酶Ⅱ原核生物DNA聚合 酶Ⅲ5'→3'3'→5'核酸外切核酸外切聚合功能DNA聚合酶5'→3'大肠杆菌3种DNA聚合酶的性质比较

催化活性负责链的延长＋＋ 切去引物物RNA，补上＋＋＋DNA聚合原物20真核生物的DNA聚合酶

在复制延长中起催化作用在没有其他DNA-pol时才发挥催化作用 在线粒体DNA复制中起催化作用在复制延长中起催化作用 在复制过程中起校读、修复和填补缺 口的作用DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

真核生物的DNA聚合酶 在复制延长中起催化作用DNA-2110.DNA连接酶（ligase）

将不连续的DNA片段以磷酸二酯键连接起来，原核生物通过分解NAD为NMN和Pi提供能量，真核生物则消耗ATP10.DNA连接酶（ligase） 将不连续的DNA片段以22SM哺乳动物的细胞周期DNA合成(synthesis)期

G1分为起始、延长、终止三个阶段3.DNA的复制过程

G2SM哺乳动物的细胞周期DNA合成(synthesis)期23聚合反应的特点：1、聚合反应具有方向性:5

3

2、DNA聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的3

-OH逐个添加脱氧核苷酸，使核苷酸链不断延长。3.DNA的复制过程聚合反应的特点：1、聚合反应具有方向性:5324DNA聚合酶延伸多核苷酸链总是5’→3’方向聚合酶催化的链延长反应DNA聚合酶延伸多核苷酸链总是5’→3’方向聚合酶催化的链延25相关的几个概念：1、复制起始点（E.coli-OriC）

复制从特定的位点开始，这一位置叫复制原点。原核生物的DNA上一般只有一个复制原点，但在迅速生长时期，第一轮复制尚未完成，就在起点处启动第二轮复制。真核生物则有多个复制原点，可以同时启动复制过程。相关的几个概念：1、复制起始点（E.coli-OriC） 复26

5

3

新链3

5

3

2、复制叉（replicationfork）

复制时DNA双链解开分成二股单链，新链沿 着张开的二股单链生成，复制中形成的这种Y字形 的结构称为复制叉。

5

3

5

亲代DNA

复制方向 5新链32、复制叉（replicationfork）27A放射自显影图像orioriori复制示意B图

θ形

3、双向复制

原核生物例如E.coli，是从固定的复制起始点开始，同时向两个方向进行复制，称为双向复制。A放射自显影图像orioriori复制示意B θ 3、双向复28复制起始点真核原核

复制叉复制起始点真核原核293.DNA的复制过程

3.2DNA复制过程

3.2.1复制的起始需要解决两个问题：1、DNA解开成单链，提供模板2、合成引物，提供3

-OH末端3.DNA的复制过程需要解决两个问题：1、DNA解开成单链30DnaA蛋白辨认起始点,形成起始复合物DnaB蛋白解螺旋DnaC蛋白协助DnaB★在多种蛋白质参与下，DNA双螺旋解开，形成单链SSB维持单链稳定DnaA蛋白辨认起始点,形成起始复合物DnaB蛋白解螺旋Dn31OH★合成引物DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB5

3

3

5

OH★合成引物DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异32总结：

①复制的起始在原核生物只有一个起始点（Ori.C），而在真核生物有多个起始点。②DnaA，DnaB（解螺旋酶，rep蛋白）和DnaC参与解链，形成复制叉（replicationfork），SSB结合并稳定解开的单股DNA链；引物酶（DnaG）与上述因子、酶构成引发体（primosome），并合成RNA引物。解链造成的超螺旋，由拓扑异构酶实现超螺旋的转型，即把正超螺旋转变为负超螺旋。总结： ①复制的起始在原核生物只有一个起始点②DnaA，33辨认功能起始点并结合于位点解开DNA双链协助解螺旋酶催化RNA引物生成稳定解开的单链理顺DNA链E.coli的复制起始点名称DnaA蛋白(四聚体)解螺旋酶（DnaB蛋白，rep蛋白）DnaC蛋白引物酶（DnaG蛋白）SSB拓扑异构酶oriC（245bp的DNA组分）参与复制起始的各种因子和酶辨认功能起始点并结合于位点名称参与复制起始的各种因子和酶34原核生物复制的起始原355’3’5’DNA-polDNA-polDNA-polDNA-poldGTPdTTPdCTP dTTP

dATPdGTPdATPdCTP3.2.2DNA链的延伸

DNA聚合酶催化游离的脱氧核苷酸结合 到新链3’末端，使其不断延长。5’3’5’DNA-polDNA-polDNA-polDN36半不连续复制示意图半不连续复制示意图37这种前导链连续合成，随后链断续合成的方式，称为半不连续复制。

随后链中合成的多个DNA片段，称为冈崎片段。冈崎片段的长度原核细胞中约1000-2000个核苷酸，真核细胞中约100-200个核苷酸。这种前导链连续合成，随后链断续合成的方式，称为半不连续复制。38复制叉的推进①先导链的合成引物酶在复制原点附近合成一段RNA引物；DNA聚合酶Ⅲ(原核细胞)在引物的3'末端逐个添加脱氧核苷酸。随着复制叉的推进，亲代DNA双螺旋不断被解开，先导链也不断延伸。复制叉的推进①先导链的合成引物酶在复制原点附近合成一段R39②随后链的合成引物的合成：随后链的每个冈崎片段都需要合成RNA引物。也是由引物酶催化。冈崎片段的合成：DNA聚合酶Ⅲ(原核细胞)在引物的3'末端使DNA链延伸，直至抵达其下游的另一个冈崎片段的RNA引物的5'端。冈崎片段的连结：DNA聚合酶Ⅰ一面以其DNA聚合活性在上游冈崎片段的3'-OH末端添加脱氧核苷酸，一面以其5'→3'核酸外切活性切除引物，直至将引物全部切除。DNA连接酶将最后的缺口补好。②随后链的合成引物的合成：随后链的每个冈崎片段都需要合成40③先导链和随后链中DNA的延伸由同一个DNA聚合酶Ⅲ全酶二聚体催化随后链的模板回折成环，从而使冈崎片段的延伸方向与先导链的延伸方向一致，它们的3'末端分别落在DNA聚合酶Ⅲ全酶的双活性部位。因此，随着聚合酶的移动，两条链同时延伸。③先导链和随后链中DNA的延伸由同一个DNA聚合随后链的模41复制叉的结构复制叉的结构42

由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填补空隙，由DNA连接酶将DNA片段连接起来。在真核生物，由端粒酶（telomerase）催化在真核线性DNA的末段形成一种特殊的结构并与蛋白质结合成端粒（telomere）。3.2.3复制的终止 由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填补在真核生物，由端粒酶43

连接酶将DNA片段连接起来完成复制DNA聚合酶I正在一边切除RNA引物，一边合成新的DNA以填补空隙引物冈崎片段 连接酶将DNA片段DNA聚合酶I正在一边引物冈崎片段44大肠杆菌DNA的复制大肠杆菌DNA的复制45至少依赖三种机制1、遵守严格的碱基配对规律。聚合酶在复制 延长中对碱基的选择功能（按模板要求选 择底物）。2、复制出错时有即时的校读功能3、切除引物4、聚合时的方向5、修复作用★复制忠实性的保证至少依赖三种机制1、遵守严格的碱基配对规律。聚合酶在复制2、46聚合酶催化的链延长反应聚合酶催化的链延长反应47胸腺嘧啶二聚体

DNA的突变有点突变（碱基的错配）、碱基的缺失、DNA片段的重排等形式。4.DNA的损伤与修复

4.1DNA的损伤

DNA的突变(损伤)大多数是 自发的，是进化与分化的基础。 环境中的理化因素，如紫外 辐射引起两个嘧啶碱基的共价 聚合。许多化学诱变剂，它们 常是致癌物,如亚硝酸盐，常 导致DNA突变。胸腺嘧啶二聚体 DNA的突变有点突变（碱基4.DNA的损伤48直接修复：如光复活酶,普遍存在在生物机体中,可以把嘧啶二聚体恢复正常状态。切除修复：找出损伤位置并切除，进行修复合成并连接。重组修复：先复制再修复。子代链在对应模板链的损伤处留下 缺口，先将同源母链DNA上相应的核苷酸片段转移替补， 然后再合成一段序列填充缺口。SOS系统：复杂的应急反应。既有避免差错的修复又有引起差错的修复，后者有高变异率但也增加了生存机会。4.DNA的损伤与修复4.2DNA损伤的修复直接修复：如光复活酶,普遍存在在生物机体中,可以把嘧啶二聚体49

重组修复切除修复 重组修复50逆转录酶(reversetranscriptase)逆转录(reversetranscription)以RNA为模板，合成与其互补的DNA的过程。逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶5.逆转录作用—以RNA为模板合成DNA逆转录酶(reversetranscriptase)51

逆转录也称反转录，是某些生物（如鸡的肉瘤病毒、HIV等）的特殊复制方式。它们的遗传信息载体是RNA而不是DNA。因此，在感染细胞时，首先经过逆转录作用成为双链DNA，才能整合到宿主基因组中去。 这个过程由逆转录酶催化，它具有以RNA为模板合成DNA，水解杂交链上的RNA以及以DNA为模板合成DNA三种活性。 逆转录现象和逆转录酶（reversetranscriptase）（H.Temin，1970）是分子生物学研究中的重大发现，是对经典中心法则重 逆转录也称反转录，式。它们的遗传信息载体是RNA而不是DN52RNADNA以RNA为模板，合成DNA的过程。

反转录酶反转录酶有三个作用 以RNA为模板合成DNA(cDNA） 水解RNA模板第二以新合成单链DNA为模板合成条DNARNADNA以RNA为模板，合成DNA的过程。反转录酶有三53逆转录病毒细胞内的逆转录现象：

RNA模板

逆转录酶

DNA-RNA

杂化双链

RNA酶

单