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高效液相色谱法

highPerformancelipidchromatography高效液相色谱法

highPerformancelipid第一节概述高效液相色谱法:以气相色谱为基础,在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法一、分离原理及分类二、HPLC与GC区别三、HPLC与经典LC区别四、高效液相色谱仪流程图五、特点第一节概述高效液相色谱法:以气相色谱为基础,在经典高效液相色谱法现代食品检测技术教学课件高效液相色谱法现代食品检测技术教学课件5一、液相色谱分离原理及分类和气相色谱一样,液相色谱分离系统也由两相——固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相(或在惰性载体表面涂上一层液膜)、离子交换树脂或多孔性凝胶;流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子(以下称溶质)与溶剂(即流动相或洗脱液)以及固定相分子间的作用,作用力的大小,决定色谱过程的保留行为。根据分离机制不同,液相色谱可分为:液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。5一、液相色谱分离原理及分类二、HPLC与GC差别相同:兼具分离和分析功能,均可以在线检测主要差别:分析对象的差别和流动相的差别1.分析对象

GC:能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品,高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20%HPLC:溶解后能制成溶液的样品,不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛,占有机物的80%二、HPLC与GC差别相同:兼具分离和分析功能,均可以在线检续前2.流动相差别GC:流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力,只与固定相作用HPLC:流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力,为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素,对分离起很大作用流动相种类较多,选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3.操作条件差别

GC:加温操作

HPLC:室温;高压(液体粘度大,峰展宽小)续前2.流动相差别3.操作条件差别三、HPLC与经典LC区别主要区别:固定相差别,输液设备和检测手段1.经典LC:仅做为一种分离手段

柱内径1~3cm,固定相粒径>100μm且不均匀常压输送流动相柱效低(H↑,n↓)分析周期长无法在线检测2.HPLC:分离和分析

柱内径2~6mm,固定相粒径<10μm(球形,匀浆装柱)高压输送流动相柱效高(H↓,n↑)分析时间大大缩短可以在线检测三、HPLC与经典LC区别主要区别:固定相差别,输液设备和检高效液相色谱仪流程图1.贮液罐(滤棒,可滤去颗粒状物质)2.高压泵(输液泵)3.进样装置4.色谱柱——分离5.检测器——分析6.废液出口或组分收集器7.记录装置高效液相色谱仪流程图1.贮液罐(滤棒,可滤去颗粒状物质)一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识续前四、HPLC的特点和应用

“三高”“一快”“一广”高柱效——n=104片/米,柱效高(远高于一般LC)高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛(可分析80%有机化合物)续前四、HPLC的特点和应用“三高”“一快”第二节基本理论一、HPLC基本知识二、塔板理论三、速率理论热力学理论:塔板理论——平衡理论基础动力学理论:速率理论——Vander方程第二节基本理论一、HPLC基本知识热力学理论:一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识一、HPLC基本知识二、塔板理论(马丁,1941)二、塔板理论(马丁,1941)三、速率理论(与GC对比)(VanDeemter,1956)

1.2.三、速率理论(与GC对比)(VanDeemter,19563)传质阻抗项及其影响可分为流动相传质阻力项Hm和固定相传质阻力项Hs。a.流动相传质阻力项:组分分子由流动相移向固定相表面进行两相之间的能量交换所受到的阻力Hm=Cmdp2u/Dg式中:Cm为与k有关的函数,dp固定相颗粒直径,Dm组分在流动性中的扩散系数。b.固定相传质阻力项Hs分子进入固定相后,扩撒到固定相内部,达到分配平衡后,又回到界面再逸出界面被流动相带走所受到阻力。Hs=CsDf2u/Ds

式中:Cs为与k有关的常数,Df固定液的液膜厚度,Ds试样分子在固定液中的扩散系数。它与气相色谱法中传质阻力项的含义相同。

3)传质阻抗项及其影响图示H-u曲线图示H-u曲线改善HPLC分析措施:

①进样时间要短。

②填料粒度要小。

③改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾,甚至不可逆吸附。

④适当的流速。

⑤较小的检测器死体积。

改善HPLC分析措施:

①进样时间要短。

②填料粒度要小。柱外效应

速率理论研究的是柱内峰展宽因素,实际在柱外还存在引起峰展宽的因素,即柱外效应(色谱峰在柱外死空间里的扩展效应)。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和,

即:

σ2=σ2柱内+σ2柱外+σ2其它

柱外效应主要由低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应,首先应尽可能减少柱外死体积,如使用"零死体积接头"连接各部件,管道对接宜呈流线形,检测器的内腔体积应尽可能小。柱外效应

速率理论研究的是柱内峰展宽因素,实际在柱外还存高效液相色谱仪流程图1.贮液罐(滤棒,可滤去颗粒状物质)2.高压泵(输液泵)3.进样装置4.色谱柱——分离5.检测器——分析6.废液出口或组分收集器7.记录装置第三节高效液相色谱仪高效液相色谱仪流程图1.贮液罐(滤棒,可滤去颗粒状物质)第三第二节高效液相色谱仪色谱柱进样阀流动相检测器高压泵脱气装置第二节高效液相色谱仪色谱柱进样阀流检测器高压泵脱气装置30高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统等五大部分组成(图14-2)。分析前,选择适当的色谱柱和流动相,开泵,冲洗柱子,待柱子达到平衡而且基线平直后,用微量注射器把样品注入进样口,流动相把试样带入色谱柱进行分离,分离后的组分依次流入检测器的流通池,最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时,检测器把组分浓度转变成电信号,经过放大,用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。30高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、31一、高压输液系统输液泵应具备如下性能:①流量稳定,其RSD应<0.5%,这对定性定量的准确性至关重要;②流量范围宽,分析型应在0.1~10ml/min范围内连续可调,制备型应能达到100ml/min;③输出压力高,对一般分离,60×105Pa的压力就满足了,对高效分离,要求达到150~300×105Pa;④液缸容积小;⑤密封性能好,耐腐蚀。31一、高压输液系统321.泵的种类按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。321.泵的种类溶剂进入:活塞收回、腔内形成低压入口阀打开,出口阀感应压差而闭合溶剂输出:活塞推出、腔内压力增加出口阀打开,入口阀感应压差而闭合单向阀的特点:密封性能相当好可以非常敏感地感应压差而迅速闭合这种泵具有清洗容易,更换流动相方便等优点,但脉动性较大是其缺点。目前多采用双泵补偿法来克服这一问题。

往复泵的工作原理溶剂进入:往复泵的工作原理并联往复泵的工作原理并联往复泵的工作原理泵的使用注意事项①防止任何固体微粒进入泵体。②流动相不应含有任何腐蚀性物质。③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完,否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环,最终产生漏液。④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力,否则会使高压密封环变形,产生漏液。⑤流动相应该先脱气,以免在泵内产生气泡,影响流量的稳定性,如果有大量气泡,泵就无法正常工作。泵的使用注意事项高效液相色谱法现代食品检测技术教学课件高效液相色谱法现代食品检测技术教学课件高效液相色谱法现代食品检测技术教学课件392.梯度洗脱装置

梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例,从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化,达到提高分离效果,缩短分析时间的目的。梯度洗脱装置分为两类:一类是外梯度装置(又称低压梯度),流动相在常温常压下混合,用高压泵压至柱系统,仅需一台泵即可。另一类是内梯度装置(又称高压梯度),将两种溶剂分别用泵增压后,按电器部件设置的程序,注入梯度混合室混合,再输至柱系统。

梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度,来调整混合样品中各组分的k值,使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温,所不同的是,在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的,而不是借改变温度(温度程序)来达到。

392.梯度洗脱装置高效液相色谱法HPLCHighPerformanceLiquidChromatography梯度洗脱(淋洗)低压梯度高压梯度PUMPPUMPPUMP浓度时间高效液相色谱法HPLC梯度洗脱(淋洗)低压梯度PUMPPU41梯度洗脱时选择溶剂应注意:①要注意溶剂的互溶性。②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高,以保证良好的重现性。③混合溶剂的粘度常随组成而变化,因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理,使其恢复到初始状态。4142二、进样系统

进样系统包括进样口、注射器和进样阀等,包括自动进样器。它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。进样装置要求:密封性好,死体积小,重复性好,保证中心进样,进样时对色谱系统的压力、流量影响小。1.隔膜进样。用微量注射器将样品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内,可把样品直接送到柱头填充床的中心,死体积几乎等于零,可以获得最佳的柱效,且价格便宜,操作方便。但不能在高压下使用(如10MPa以上),而且能耐各种溶剂的橡皮不易找到,常规分析使用受到限制。2.停流进样。可避免在高压下进样。但在HPLC中由于隔膜的污染,停泵或重新启动时往往会出现"鬼峰";另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中,效果较好。3.阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀(以美国Rheodyne公司的7725和7725i型最常见),其关键部件由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。由于阀接头和连接管死体积的存在,柱效率低于隔膜进样(约下降5~10%左右),但耐高压(35~40MPa),进样量准确,重复性好(0.5%),操作方便。42二、进样系统进样阀六通阀设计耐高压,低死体积可以手动或自动旋转进样阀自动进样的重复性优于手动进样进样阀六通阀设计手动进样阀的进样注意:一定使用平头微量进样针手动进样阀的进样注意:一定使用平头微量进样针进样—层流效应当样品注入定量环时,环中的流动相将被取代样品于流动相之间的界面呈抛物线状,称为层流效应全定量环进样时,必须考虑层流效应的影响进样—层流效应当样品注入定量环时,环中的流动相将被取进样—层流效应以定量环的体积定量对一般样品而言,进样体积需大于定量环的2.5倍>4倍则更加保险倍数进样—层流效应以定量环的体积定量倍数进样—进样量全定量环进样准确,但浪费样品至少需要2.5倍进样体积的样品部分定量环进样进样量<进样环体积的一半无层流效应的影响误差来源于进样针及操作人员使用内标法将可以提高进样的准确度进样—进样量全定量环进样48三、分离系统分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类,尺寸规格也不同:①常规分析柱(常量柱),内径2~5mm(常用4.6mm,国内有4mm和5mm),柱长10~30cm;②窄径柱(narrowbore,又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn),内径1~2mm,柱长10~20cm;③毛细管柱(又称微柱microcolumn),内径0.2~0.5mm;④半制备柱,内径>5mm;⑤实验室制备柱,内径20~40mm,柱长10~30cm;⑥生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定,目的是为了避免管壁效应。48三、分离系统49柱的使用注意事项

①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。②应逐渐改变溶剂的组成,特别是反相色谱中,不应直接从有机溶剂改变为全部是水,反之亦然。③色谱柱不能反冲,否则会迅速降低柱效。④选择使用适宜的流动相(尤其是pH),以避免固定相被破坏。。⑤避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内,需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。⑥经常用强溶剂冲洗色谱柱,清除保留在柱内的杂质⑦保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇,柱接头要拧紧,防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。49柱的使用注意事项四、检测器

作用:检测色谱柱流出物组份浓度的变化理想的检测器:灵敏度高重复性好不引起柱外谱带扩展线性范围宽死体积小检测器响应对流量及温度变化不敏感四、检测器作用:检测色谱柱流出物组份浓度的变化检测器分类按检测对象分类整体性检测器:检测流动相的总体物理性质如:示差折光检测器、电导检测器灵敏度低、易受温度影响的波动、不适合梯度洗脱溶质性检测器:测量溶质的某种特性或物化性质的变化如:紫外检测器、荧光检测器流动相不能有紫外吸收按选择性分类

选择性检测器:紫外检测器、二极管阵列检测器、荧光检测器、电导检测器通用性检测器:示差折光检测器

蒸发光检测器检测器分类按检测对象分类检测器的噪音和漂移

噪音和漂移反应了检测器的稳定性噪音无溶剂通过检测器时,输出信号的变化电路及泵的脉冲引起短噪音,不影响色谱峰的分辨率,但影响检测限长噪音来自检测器本身、或流动池有气泡,温度及流量的变化也会引起长噪音漂移基线随时间增加朝单一方向偏移电源电压不稳、温度及流动相发生缓慢变化对分析误差及检测能力有影响检测器的噪音和漂移噪音和漂移反应了检测器的稳定性检测器的技术指标灵敏度检测器的主要性能指标,样品进入检测器的响应信号灵敏度越高检测限越低检测限两倍噪音时所需要的样品量检测限低、检测性能强、检测时所需要的样品少线性范围

检测信号与被检测物呈线性关系的范围下限定义为两倍噪音检测器的技术指标灵敏度紫外-可见波长检测器(UVDetector)应用范围最广泛的检测器大约占使用的70%

紫外光区:190~370nm特点灵敏度高、噪音低、线性范围宽为溶质型检测器、对流速和温度的变化不敏感为选择性检测器,必须使用无紫外吸收的溶剂作流动相为浓度型检测器为非破坏性检测器,可与制备色谱或其他设备串联结构简单、维护方便紫外-可见波长检测器(UVDetector)应用范围最广I0IAbsorbedradiationTransmittedradiationIncidentradiationReflectionbA=log()=εbcIoI紫外-可见波长检测器工作原理朗伯-比尔定律:吸光度与化合物的浓度成正比I0IAbsorbedTransmittedradiati理论检测限估算摩尔吸光系数ε(A=εbc)紫外检测器灵敏度很大程度取决于样品的

ε值ε

与物质分子结构有关

估算最低检测浓度

CminCmin=3ND/εb(ND噪声)摩尔吸光系数影响检测灵敏度

估算最小检测量

MminMmin=Cminx进样体积理论检测限估算摩尔吸光系数ε(A=εbc)

紫外-可见波长检测器的光学系统紫外-可见波长检测器的光学系统二极管阵列检测器

DiodeArrayDetector光学特性光电二极管阵列

棱镜分光系统二极管阵列检测器

DiodeArrayDetectorDADUVDADUV二极管阵列检测器的数据分析功能二极管阵列检测器的数据分析功能荧光检测器

FluorescenceDetector

原理

从电子跃迁的角度来讲,荧光是指某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光线以后,原子中的某些电子从基态中的最低振动能级跃迁到较高的某些振动能级。电子在同类分子或其他分子中撞击,消耗了相当的能量,从而下降到第一电子激发态中的最低振动能级,能量的这种转移形式称为无辐射跃迁。由最低振动能级下降到基态中的某些不同能级,同时发出比原来吸收的频率低、波长长的一种光,就是荧光。被化合物吸收的光称为激发光,产生的荧光称为发射光。荧光的波长总要长于分子吸收的紫外光波长,通常在可见光范围内。荧光的性质与分子结构有密切关系,不同结构的分子被激发后,并不是都能发射荧光。荧光检测器

FluorescenceDetector原理荧光检测器选择性和灵敏度均较高紫外检测器高。荧光检测器荧光检测器有机发光化合物分为三类:

(1)具有刚性结构的芳香稠环化合物;

(2)具有共轭结构的分子内电荷转移化合物;

(3)某些金属有机物(Al3+,Mg2+)与一些有机物形成配合物。荧光检测器示差折光检测器

Differentialrefractiveindexdetector

通用型检测器

溶剂选择合适几乎可测所有的物质

原理示差检测器连续检测样品流路与参比流路间液体折光指数差值折射率:光在真空的速度和在某介质中的速度之比光由一种介质进入另一种介质时发生折射现象

折射率随温度升高而降低

同一介质对不同波长的光有不同折射率

示差折光检测器

Differentialrefracti示差折光检测器光学系统示差折光检测器光学系统

示差折光检测器的特点

属通用型检测器响应值取决于柱后流出液折射率变化

适合检测

无紫外吸收的物质

流动相溶剂具有高紫外吸收

浓度敏感型检测器

响应信号与溶质浓度成正比

中等灵敏度检测器

不适合痕量分析

示差折光检测器的特点属通用型检测器示差折光检测器的特点(续)对压力、温度变化相当敏感

需配置柱温箱

最常用的溶剂是水

不适合梯度洗脱

检测要求

流动相组成须恒定

控制恒温

控制压力恒定

出口处不可以加限流装置

检测器串联时,RI应放在最后

水甲醇和水CH3CN混合物折射率示差折光检测器的特点(续)对压力、温度变化相当敏感水甲醇和蒸发光散射检测器

EvaporativeLight-scatteringDetector蒸发光散射检测器(EvaporativeLight-scatteringDetector)是通用型检测器,可以检测没有紫外吸收的有机物质,如人参皂苷、黄芪甲苷等。1993才由Alltech公司商业化生产。ELSD工作原理

恒定流速的色谱仪洗脱液进入检测器后,首先被高压气流雾化,雾化形成的小液滴进入蒸发室,流动相及低沸点的组分被蒸发,剩下高沸点组分的小液滴进入散射池,光束穿过散射池时被散射,散射光被光电管接收形成电信号,电信号通过放大电路、模数转换电路、计算机成为色谱工作站的数字信号——色谱图。

蒸发光散射检测器

EvaporativeLight-sc组分的气溶胶喷雾蒸发检测N2光源溶剂泵色谱柱流出物注意:流动相必须是挥发性的,不能含缓冲盐,若调节pH可用氨水、醋酸。组分的气溶胶喷雾蒸发检测N2光源溶剂泵色谱柱流出物注意:流动蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器71第四节高效液相色谱的固定相

和流动相一、固定相高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类,可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质,可承受7.0

108~1.0

109Pa的高压,可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团,可扩大应用范围,它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中,它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5

108Pa。71第四节高效液相色谱的固定相

72固定相按孔隙深度分类,可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。1.表面多孔型固定相它的基体是实心玻璃球,在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料,如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅,相对死体积小,出峰迅速、柱效亦高;颗粒较大,渗透性好,装柱容易,梯度淋洗时能迅速达到平衡,较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄,最大允许量受到限制。2.全多孔型固定相由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细(5~10

m),孔仍然较浅,传质速率快,易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。目前应用范围广。

72固定相按孔隙深度分类,可分为表面多孔型和全多孔型固定相两73二、流动相由于高效液相色谱中流动相是液体,它对组分有亲合力,并参与固定相对组分的竞争,因此,正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是:(1)溶剂对于待测样品,必须具有合适的极性和良好的选择性。(2)溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器,应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂73二、流动相74的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时,溶剂对此辐射产生强烈吸收,此时溶剂被看作是光学不透明的,它严重干扰组分的吸收测量。对于折光率检测器,要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相,以达到最高灵敏度。(3)高纯度由于高效液相色谱灵敏度高,对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳,或产生“伪峰”。74的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过75一般不用乙醇做流动相75一般不用乙醇做流动相767677(4)化学稳定性好(5)低粘度(粘度适中)若使用高粘度溶剂,势必增高压力,不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等;但粘度过低的溶剂也不宜采用,例如戊烷和乙醚等,它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡,影响分离。77(4)化学稳定性好78流动相的极性选择:1)采用正相液-液分配分离时:首先选择中等极性溶剂,若组分的保留时间太短,降低溶剂极性,反之增加。也可在低极性溶剂中,逐渐增加其中的极性溶剂,使保留时间缩短。2)液固吸附色谱法时,极性大的试样需要用极性强的洗脱剂,极性弱得试样用极性弱得洗脱剂。常用溶剂的极性顺序:水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)。78流动相的极性选择:第五节高效液相色谱法分类一、液固吸附色谱法(LSC)二、液液分配色谱法(LLC)三、化学键合相色谱法(BPC)四、离子交换色谱法五、凝胶色谱法第五节高效液相色谱法分类一、液固吸附色谱法(80一、液—固色谱法原理:流动相为液体,固定相为吸附剂(如硅胶、氧化铝等)。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是:当试样进入色谱柱时,溶质分子(X)和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附(未进样时,所有的吸附剂活性中心吸附的是S),可表示如下:Xm+nSa======Xa+nSm式中:Xm--流动相中的溶质分子;Sa--固定相中的溶剂分子;Xa--固定相中的溶质分子;Sm--流动相中的溶剂分子。当吸附竞争反应达平衡时:K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]式中:K为吸附平衡常数。80一、液—固色谱法原理:81一、液固色谱法固定相液固色谱法采用的固体吸附剂按其性质可分为极性和非极性两种类型。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等,碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱,如脂肪胺和芳香胺。碱性吸附剂则适于分离酸性溶质,如酚、羧和吡咯衍生物等。各种吸附剂中,最常用的吸附剂是硅胶,其次是氧化铝。在现代液相色谱中,硅胶不仅作为液固吸附色谱固定相,还可作为液液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基体81一、液固色谱法固定相82液-固吸附色谱流动相液相色谱的流动相必须符合下列要求:(1)能溶解样品,但不能与样品发生反应。(2)与固定相不互溶,也不发生不可逆反应。(3)粘度要尽可能小,这样才能有较高的渗透性和柱效。(4)应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时,溶剂要不吸收紫外光。(5)容易精制、纯化、毒性小,不易着火、价格尽量便

宜等。在液-固色谱中,选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相,极性小的则用低极性流动相。8283二、液液色谱法

液液色谱又称液液分配色谱。原理:流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶(极性不同,避免固定液流失),有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱,溶质在两相间进行分配。达到平衡时,服从于下式:式中,cs—溶质在固定相中浓度;cm--溶质在流动相中的浓度;Vs—固定相的体积;Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处,即分离的顺序取决于K,K大的组分保留值大;但也有不同之处,GPC中,流动相对K影响不大,LLPC流动相对K影响较大。83二、液液色谱法液液色谱又称液液分配色谱。84一、固定相液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类:(1)表面多孔型载体(薄壳型微珠载体),由直径为30~40

m的实心玻璃球和厚度约为1~2m的多孔性外层所组成。(2)全多孔型载体,由硅胶、硅藻土等材料制成,直径30~50m的多孔型颗粒。(3)全多孔型微粒载体,由nm级的硅胶微粒堆积而成,又称堆积硅珠。这种载体粒度为5~10m。由于颗粒小,所以柱效高,是目前使用最广泛的一种载体。由于液相色谱中,流动相参与选择作用,流动相极性的微小变化,都会使组分的保留值出现较大的差异。因此,液相色谱中,只需几种不同极性的固定液即可。如,—氧二丙腈(ODPN),聚乙二醇(PEG),十八烷(ODS)和角鲨烷固定液等。

84一、固定相二、流动相在液液色谱中,除一般要求外,还要求流动相对固定相的溶解度尽可能小,因此固定液和流动相的性质往往处于两个极端,例如当选择固定液是极性物质时,所选用的流动相通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂。a.正相液液分配色谱法:流动相的极性小于固定液的极性。b.反相液液分配色谱法:流动相的极性大于固定液的极性。

以极性物质作为固定相,非极性溶剂作流动相的液液色谱,称为正相分配色谱,适合于分离极性化合物;反之,如选用非极性物质为固定相,而极性溶剂为流动相的液液色谱称为反相分配色谱,这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。二、流动相86三、化学键合相色谱70年代初发展了一种新型的固定相—化学键合固定相。这种固定相是通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶(载体)表面的游离羟基上,代替机械涂渍的液体固定相。这不仅避免了液体固定相流失的困扰,还大大改善了固定相的功能,提高了分离的选择性,化学键合色谱适用于分离几乎所有类型的化合物。86三、化学键合相色谱70年代初发展了一种新型的固定键合固定相OHOHOHOOO+C18H37SiCl3SiC18H37非极性键合固定相:键合在载体表面的功能分子是烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS(OctaDecyltrichloroSilane)柱或C18柱就是最典型的代表,其极性很小。极性键合固定相:键合在载体表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。键合固定相OHOHOHOOO+C18H37SiCl3Si正相HPLC(normalphaseHPLC): 是由极性固定相和非极性(或弱极性)流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等,代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。反相HPLC(reversedphaseHPLC): 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系,与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱),代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。ODS(OctaDecyltrichloroSilane)正相HPLC(normalphaseHPLC):一、化学键合固定相化学键合固定相一般都采用硅胶(薄壳型或全多孔微粒型)为基体。在键合反应之前,要对硅胶进行酸洗、中和、干燥活化等处理,然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应,制备化学键合固定相。键合相可分为四种键型:(1)硅酸酯型(=Si-O-C)键合相将醇与硅胶表面的羟基进行酯化反应,在硅胶表面形成(=Si-O-C)键合相。反应生成单分子层键合相。一般用极性小的溶剂洗脱,分离极性化合物。(2)硅氮型(=Si-N)键合相如果用SOCl2将硅胶表面的羟基先转化成卤素(氯化),再与各种有机胺反应,可以得到各种不同极性基因的键合相。可用非极性或强极性的溶剂作为流动相。一、化学键合固定相(3)硅碳型(=Si-C)键合相将硅胶表面氯化后,使Si-Cl键转化为Si-C键。在这类固定相中,有机基团直接键合在硅胶表面上。(4)硅氧烷型(=Si-O-Si-C)键合相

将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。这类键合相具有相当的耐热性和化学稳定性,是目前应用最为广泛的键合相。(3)硅碳型(=Si-C)键合相二、反相键合相色谱法

在反相色谱中,一般采用非极性键合固定相,如硅胶-C18H37(简称ODS或C18)硅胶-苯基等,用强极性的溶剂为流动相,如甲醇/水,乙腈/水,水和无机盐的缓冲液等。

目前,对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法,大致有两种观点:一种认为属于分配色谱,另一种认为属于吸附色谱。

在反相键合相色谱中,极性大的组分先流出,极性小的组分后流出。二、反相键合相色谱法三、正相键合色谱法

在正相色谱中,一般采用极性键合固定相,硅胶表面键合的是极性的有机基团,键合相的名称由键合上去的基团而定。最常用的有氰基(-CN)、氨基(-NH2)、二醇基(DIOL)键合相。流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂,如烃类溶剂,或其中加入一定量的极性溶剂(如氯仿、醇、乙腈等),以调节流动相的洗脱强度。通常用于分离极性化合物。三、正相键合色谱法一般认为正相色谱的分离机制属于分配色谱。组分的分配比K值,随其极性的增加而增大,但随流动相中极性调节剂的极性增大(或浓度增大)而降低。同时,极性键合相的极性越大,组

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