基于ssr引物的保持池和恢复池的多态性分析

基于ssr引物的保持池和恢复池的多态性分析

植物细胞的不良性育种利用是小麦混合优势方法的有效手段。它避免了人工雄花的人工去除过程、工作量、效率低下，以及化学雄花的长期破坏。因此，它的应用前景非常广阔。V型小麦细胞质雄性不育系(V-CMS)与T型小麦细胞质雄性不育系(T-CMS)相比优点更多,它没有明显的不良胞质效应,易恢复且恢复源广,不育系种子饱满,有很好的利用前景。恢复系的选育是利用CMS系统配制杂交种的前提之一,而选育恢复系比常规育种具有更多的困难,主要表现在恢复基因的有无只能在测交后代中鉴定,加上分离世代不可能逐株测交。利用DNA分子标记能在幼苗期对分离世代的植株进行鉴定,通过筛选与育性恢复基因连锁的DNA分子标记,可以对恢复基因进行精确定位,并为最终克隆育性恢复基因打下基础。目前利用DNA分子标记对CMS恢复基因的定位研究在水稻、玉米、油菜、黑麦、甜乘、向日葵等作物上都取得了很大进展,在小麦CMS育性恢复基因的定位研究中,对T-CMS研究的最早也最深入。近年来利用DNA分子标记对K-CMS的恢复基因也有了一定研究,但是利用DNA分子标记对V-CMS恢复基因的研究还未见报道。SSR是近年来发展起来的一类理想的DNA分子标记。本试验利用SSR分子标记对V-CMS恢复系济南13的恢复基因进行了定位分析。1材料和方法1.1恢复池的制备V911289A是偏凸山羊草细胞质的小麦雄性不育系,97美斯6对V911289A有保持能力,济南13对V型不育系具有较高的恢复力。2001年配制(济南13/97美斯6)F1,2002年以V911289A为母本,以(济南13/97美斯6)F1为父本进行测交,2003年对测交单株进行挂牌编号及套袋自交,提取相应单株的DNA,成熟后按国内法考查各株的套袋自交结实率。结实率大于70%的极端类型含有主效育性恢复基因作为可育株,不结实的完全不育株不含有主效恢复基因。选取自交不结实的15个单株,每株取等量DNA混合构建保持池;选取自交结实率大于75%的15个单株,每株取等量DNA混合构建恢复池。在亲本和两个池中用SSR标记筛选多态性差异,筛选到稳定差异标记,再对测交群体进行分析。1.2ssr-pcr扩增所用SSR引物是根据R⌀der(1998)等报道的序列经上海生物工程有限公司合成的。SSR标记的PCR扩增反应在BiometraT1Thermo-cycler上进行,反应体系为25μl,模板DNA90ng,10mmol/LTris-HCl(pH8.3),50mmol/LKCl,2.0mmol/LMgCl2,0.15mmol/LdNTP,50ngPrimers,1UTaqDNA聚合酶。PCR扩增条件为:94℃预变性3min;94℃变性1min,50、55℃或60℃退火1min(退火温度因引物不同而不同),72℃延伸2min,共进行35个循环;72℃后延伸10min。SSR扩增产物采用4.5%变性聚丙烯酰胺凝胶恒功率(80W)电泳约50min,银染检测。聚丙烯酰胺凝胶银染程序:10%的醋酸1000ml固定20min,去离子水漂洗10min,0.12%硝酸银1000ml(加入2ml的甲醛)染色30min,用去离子水快速漂洗5s,然后用3%的碳酸钠溶液1000ml(预冷至10℃以下,临用前加入0.8ml甲醛,200μl10%硫代硫酸钠溶液)显影至DNA带型清晰,加入10%的醋酸3min终止反应,最后用去离子水漂洗约10min。2结果与分析2.1主效恢复基因和微效基因共同控制v型育性恢复考查了250个(V911289A//济南13/97美斯6)测交单株的自交结实率,其结实率呈连续分布(图1),但不呈正态分布,在0%和60%各有一个峰值,且前者峰值较高,说明济南13对V型不育系的育性恢复受主效恢复基因和众多微效基因共同控制。在250个测交单株中,结实率低于60%的有175株,而结实率高于80%的仅有26株,由此也说明济南13对V911289的恢复力并不是很强,还需要选育恢复力更强的恢复系。2.2扩增位点xgwm264利用SSR引物对亲本济南13和97美斯6以及保持池和恢复池进行了筛选,发现SSR引物GWM11、GWM18、GWM264和GWM273的扩增位点Xgwm11、Xgwm18、Xgwm264和Xgwm273在两亲本(济南13和97美斯6)之间都有稳定的差异,但通过分离群体验证后发现它们的交换值分别为78.9%、78.1%、79.8%和76.3%,都大于50%(图2),超过了遗传交换的理论界限,出现了一种令人难以想象的结果。3恢复系的分子检测1999年柴守诚等对K、V型不育系育性恢复进行了比较研究,发现K型不育系的育性恢复主要受1BS上的Rfv1基因控制,而V型不育系的育性恢复则受Rfv1和1D染色体上的育性恢复基因共同控制,并且认为二者具有互补性和累加性,比K型不育系更复杂,而且发现在保持1D正常剂量的情况下,使恢复系中携带Rfv1的1B染色体(片断)加倍能够提高V型不育系的恢复度。但在本研究中只是在1BS上发现了有差异的标记,但在1DS上并未发现。于天峰在研究中发现,V型不育系的恢复源较广,但具有高恢复度的恢复源不多,不同的材料恢复力差别很大,并且发现恢复力高的恢复系都具有两对独立遗传的主效基因,而低恢复力的恢复系只含有一对主效基因。本试验通过对测交后代自交结实率分析发现,在250个单株中结实率大于10%的单株有176株,占到了70.4%,但是结实率大于80%的单株只有26株,仅占10.4%。可以看出济南13能够恢复V91128A的育性,但是恢复度并不很高,所以济南13很可能只有一对育性恢复基因。本研究在1BS上找到的在两亲本(济南13和97美斯6)之间有差异的4个SSR引物,恰好与刘保申等找到的与K型不育系育性恢复基因有连锁关系的引物一样,在分子水平也验证了K、V型不育系具有很大的相似性。但通过分离群体验证后发现它们的交换值都大于50%,超出了遗传交换的理论界限(50%),这应该是不可能的。在分离群体验证中我们也发现,在不育群体中出现了多数与恢复系亲本济南13相同的带,而在可育群体中出现了多数与保持系97美斯6相同的带,与理论情况正好相反(如图2)。出现这种怪异的现象可能有以下原因:(1)恢复系和保持系的DNA样颠倒了。如果把这两亲本的带型反过来分析,这4个引物的扩增位点与恢复基因间的交换值就变成了21.1%、21.9%、20.2%和23.7%,这样就完全符合理论交换值的要求了。但是经过我们多次重新提取这两亲本的DNA样进行验证,确认亲本DNA样并没有颠倒。(2)测交单株自交结实率考种的结果不准确。但是根据连续两年的重复测交、考种的结果确定的极端分离群体中出现的带型趋势基本相同。而且,如果只是因为考种结果不准确的原因,很难出现在不育群体中有多数可育