水溶性蛋白的提取性质功能测定

水溶性蛋白的提取功能性质测定专业：09生教学号：060109129姓名：陈苏舍予摘要：本文以测定大豆中蛋白质的相对分子质量的为目的，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，以大豆为例阐述了实验室测定蛋白质相对分子质量的方法，论证了此方法的可行性极其效果，得出了大豆中蛋白质相对分子质量的多少。关键词：SDS相对分子质量大豆蛋白质引言：十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate,简称SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量，是六十年代末Weber和Osborn在Shapiro等人在实验基础上发展起来的一项新技术。用这种方法测定蛋白质的分子量具有快速灵便，设备简单等优点。实验原理：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质的电泳迁移率在一般的电泳方法中，主要取决于它在某pH下所带的净电荷量、分子大小（即分子量）和形状的差异性，而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对大多数蛋白质，主要取决于它们的分子量，与原有的电荷量和形状无关。SDS是一种阴离子表面活性剂，在一定的条件下，它能打开蛋白质氢键和疏水键，并按比例地结合到这些蛋白质分子上形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，每克蛋白质一般结合1.4克SDS。SDS与蛋白质的定比结合使蛋白质-SDS复合物均带上相同的负电荷，其量远远超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了蛋白质间原有的电荷差异。在水溶液中，蛋白质-SDS复合物具有相同的构象，近似雪茄烟形的长椭园棒(短轴均为1.8nm，长轴则随蛋白质的分子量成正比变化)，克服了蛋白质间原有的形状差异。这样蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。蛋白质分子量与电泳迁移率间的关系可用下式表示：lgMr二K-bm式中Mr为分子量；K为常数；b为斜率；m为迁移率。因此，用本法测定蛋白质的分子量只需根据待测蛋白质在已知分子量的标准蛋白质的lgMr~迁移率的图中的位置，就能得知分子量。用本法测得的分子量，除单链蛋白质外，均不是天然蛋白质的完整分子量，而是组成这些蛋白质的亚基或肽链的分子量。本法对一些电荷异常，或构象异常，或带有大辅基的蛋白质不适用，如组蛋白F1和某些糖蛋白等。对一些结构蛋白如胶原蛋白等也不适用。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按照凝胶电泳系统中的缓冲液、pH值和凝胶孔径的差异可分为SDS-连续系统电泳和SDS-不连续系统电泳两类；按照所制成的凝胶形状和电泳方式又可以分为SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直管型电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳两类。本实验采用SDS-连续垂直板型操作方法。实验器材：试管1.5cm*15cm(*9)移液管0.10ml(*1),0.50ml(*2),2.0ml(*1),5.0ml(*1)容量瓶1000ml(*1)量筒100ml(*1)电子分析天平直流稳压电泳仪垂直平板电泳仪移液枪（1.0ml、200|il、20|il）微量注射器（20叫）烧杯、试管、滴管、冰箱实验试剂：重蒸水标准蛋白液：牛血清蛋白（0.1mg/ml），准确称取牛血清蛋白0.2g，用蒸馏水溶解并稀释至2000ml。染液：考马斯亮蓝G250（0.01%），称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸，然后加蒸馏水定容至1000ml。凝胶储备液：丙烯酰胺29.2g，亚甲基双丙烯酰胺0.8g,加重蒸水至1000ml。夕卜包锡纸，4°C冰箱保存，30填以内使用。分离胶缓冲溶液：1.5mol/LTris-HCl,PH8.818.15gTris（三羟甲基氨基甲烷），加约80ml重蒸水，用1mol/LHCl调至PH8.8，用重蒸水稀释至最终体积为100ml,4°C冰箱保存。浓缩胶缓冲夜：0.5mol/LTris-HCl,PH6.86gTris,加约60ml重蒸水，用1mol/LHCl调至PH6.8,用重蒸水稀释至最终体积为100ml,4°C冰箱保存。10%SDS,室温保存2倍非还原缓冲液重蒸水1.0ml0.5mol/LTris-HCl,PH6.82.5ml甘油2.0ml质量浓度10%SDS4.0ml质量浓度0.1%漠酚蓝0.5ml总体积10ml电极缓冲液，PH8.3Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g，加重蒸水至1000ml，4°C冰箱保存。低相对分子质量标准蛋白质，开封后溶于200|!l重蒸水，加200^2倍非还原缓冲液，封装20小管，-20°C保存。质量浓度为10%过硫酸铵：临用前配制。1.5%琼脂：1.5g琼脂粉加100ml重蒸水，加热至沸腾。染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入91ml50%甲醇，9ml冰醋酸。脱色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸与875ml重蒸水。

实验步骤：一：蛋白质含量的测定:1.标准曲线的制作取7支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。管号操作项目1237456标准蛋白质溶液（ml）—0.80.10.20.30.40.60.9%NaCl(ml)1.00.20.90.80.70.60.4蛋白质含量（pg）0102080304060盖上塞子，摇匀。放置2min后在595nm波长下比色测定（比色应在lh内完成）。以牛血清白蛋白含量（pg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。样品中蛋白质含量的测定另取1支具塞试管，准确加入0.lml样品提取液，再加入0.9ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595nm波长下比色，记录吸光度。二：SDS将垂直平板电泳槽装好，不同的电泳槽安装的方法不同，按说明书进行。

分离胶的选择和配置方法按照蛋白质不同的相对分子量选用不同浓度的分离胶。口蛋白质的相对分子量的范围分离胶的浓度〈10420%-30%1x104-4x10415%-20%4x104-1x10510%-15%1x105-5x1055%-10%〉5x1052%-5%(2)不同分离胶的配制方法分离胶的浓度20%15%12%10%7.5%重蒸水/ml0.752.353.354.054.851.5mol/LTris-HCl(pH8.8)/ml2.52.52.52.52.5质量浓度为10%SDS/ml0.10.10.10.10.1凝胶贮备液(Acr/Bis)/ml6.65.04.03.32.5质量浓度为10%过硫酸铵/ul5050505050TEMED/pl55555总体积/ml1010101010分离胶的灌制根据待测蛋白质样品的相对分子量选择合适的分离胶浓度，本实验选用血管内皮生长因子(VEGF)为待测相对分子质量的样品(常用的VEGF的相对分子质量约为44000，还原后为22000。)，用12%的分离胶。在15ml试管中依次加入重蒸水3.35ml、1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)缓冲液2.5ml10%SDS0.1ml、凝胶贮备液4.0ml、10%过硫酸铵50pl和TEMED5pl，由于加入TEMED后凝胶就开始聚合，所以应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，留出梳齿的齿高加1cm的空间以便灌注浓缩胶。用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约30~60min，分离胶则聚合，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水，尽可能去干净。浓缩胶的配制和灌制一般采用5%的浓缩胶配制方法重蒸水2.92ml、0.5mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8)1.25ml、10%SDS0.05ml、凝胶贮备液(Acr/Bis)10%过硫酸铵25pl、TENED5pl,在试管中混匀，灌注在分离胶上。小心插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置于室温下至浓缩胶完全聚合(约30min)。5样品的制备标准蛋白样品的制备取出一管预先分装好的20pl低相对分子质量标准蛋白质，放入沸水浴中加热3~5min，取出冷至室温。待测样品的制备10plVEGF(5pgVEGF)加10pl2倍还原缓冲液。10plVEGF(5pgVEGF)加10pl2倍非还原缓冲液。以上a、b两管均同标准蛋白质样品一样，在沸水浴中加热3~5min，取出冷至室温。电泳（1）待浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳齿，用电极缓冲液洗涤加样孔（梳孔）数次，然后将电泳槽注满电极缓冲液。（2） 用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样。（3） 接上电泳仪，上电极接电源的负极，下电极接电源的正极。打开电泳仪电源开关，调节电流至20~30mA并保持电流强度恒定。待蓝色的漠酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1cm时，停止电泳。染色与脱色小心将胶取出，置于一大培养皿中，在漠酚蓝条带的中心插一细钢丝作为标志。加染色液染色1h，倾出染色液，加入脱色液，数小时更换一次脱色掖，直至背景清晰。注意事项：所有标注要即用即配的药品都要注意不能提前配制，所有标注低温保存的药品和试剂都要低温保存，不能随意乱放。配制溶液是要仔细小心，一旦溶液配制出错，要第一时间发现并重新配制。配制溶液的量一定要充足，就算在实验失败的情况下也要预留足够的试剂。配制染色液时要注意分清考马斯亮蓝的型号。配制溶液时移液管、药匙等不能混用，试剂瓶的盖子用完及时关上，以免污染试剂。有剧毒，强腐蚀性，强氧化性，强酸，强碱试剂使用时带好手套，做好防护工作。使用容量瓶时不要忘记检漏。在测定蛋白质含量是要注意各个试管各自编号。在使用离心仪时，注意试管对称放置，天平上称量，精确到0.01g使用分光光度计的时候，注意调节波长，比色皿的光面不能触摸。在使用移液枪的时候觉得不能用手碰到枪头的下边，同时在有枪头时决不能将移液枪横放甚至倒置。用完的枪头立刻推掉。电泳槽的玻璃板在使用前一定要仔细清洗，洗完后不能用手直接触摸。电泳槽装配完后注意检漏。无论是分离胶还是浓缩胶的配制时，试剂一定要按顺序加入，在最后加入TEMED后一定要立刻使用，以免胶凝结。再加入分离胶之前，一定要保证玻璃板之间水分已完全干燥。分离胶和浓缩胶在加入玻璃板直接时一定要缓慢的用滴管沿着长板从不同地方向下滴。分离胶和浓缩胶的凝结过程中一定要保持电泳槽的水平和无振动。并且在完全凝结之前不能移动。分离胶的高度不能超过玻璃板高度的2/3。在用蒸馏水封胶的时候一定要将蒸馏水缓缓的沿长板边缘滴下，否则会将下层的分离胶平面冲散。当加入浓缩胶后在分层处有气泡，一定要用微量注射器将气泡刺破，同时不能在浓缩胶中做大幅度动作，以免浓缩胶凝结后出现褶皱。浓缩胶不能加得过满，否则梳子插进去后会溢出。待凝胶结束后，要小心的拔出梳子，让点样槽整齐的排布，若出现槽凝胶歪曲，可以使用微量注射器进行细微的调整，注意绝对不能戳破凝胶。清洗点样槽的缓冲液一定要少量，在用吸水纸吸出缓冲液时要小心不能再次污染点样槽。用微量注射器点样时要从点样槽一边均匀的点至另一边，切忌戳破凝胶。在电泳槽中加入缓冲液时要没过长板。电泳时要控制电流大小在25mA左右。电泳时要时刻注意观察，一旦条带到达最下边，要及时终止电泳。拆开玻璃板时也要小心，不能弄碎凝胶。拆开的凝胶要在染色液和脱色液中放置足够的时间。常见的问题及分析：配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS-PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。1） 还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。2） 带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。3） 非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。3.SDS电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris-HCL系统，TEMED与AP:AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基磺酸钠（SDS）:阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。4.提高SDS电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。"微笑"（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。"皱眉"（两边向下中间鼓起）形带原因？主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。什么是"鬼带”，如何处理？"鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法:在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）;适当降低电压;为什么电泳电压很高而电流却很低呢？这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）处理办法：电泳槽正确装配即可。浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。电泳时间比正常要长？可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。分离胶加上后为什么要立即加水？加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上。实验数据分析及结果：SDS:在第一次实验时，由于在称量tris的时候将6g误称为0.6g，导致分离液未制作好，分离胶未凝固