乙型肝炎病毒抗原的研究进展

乙型肝炎病毒抗原的研究进展

与hbv相关的抗炎病毒最初是在澳大利亚的土著人血清中发现的，后来被称为澳大利亚抗炎毒症。根据其他研究，乙型肝炎病毒是一个球形颗粒，相当于过去发现的dane。与hbv相关的颗粒有三种：大球形、小球形和管状，这些是dna病毒之一。人体感染肝炎病毒后，血清中可能存在三种不同的抗炎反应系统。乙型肝炎表面抗原抗体(HBsAg-HBsAb)系统,乙型肝炎表面抗原有数种抗原决定簇,组成抗原A和D、Y、W、R四个亚型抗原。因此,HBsAg有四种亚型adw、adr、ayr、ayw。由于世界地区分布不同,所含亚型不同,我国及日本、北美、北欧及太平洋地区以AD为主,非洲和澳大利亚及地中海以AY多见,而希腊以AY为主。乙型肝炎核心抗原、抗体(HBcAg-HBcAb)系统,乙型肝炎核心抗原存在于乙型肝炎病毒的核心部分,免疫电镜和荧光标记技术证明,它定位于受染肝细胞的核内,而HBsAg则生成肝细胞浆中,由此推断,在血清不能检测到核心抗原(HBcAg),但能检测到核心抗体。乙型肝炎e抗原、抗体(HBeAg-HBeAb)系统。e抗原是一种可溶性蛋白,它有e1、e2两部分,关于e抗原的本质尚无定论,但公认e抗原与病毒复制有关,它可能是受病毒感染肝细胞所合成的一种宿主抗原,HBeAg只能在HBsAg阳性患者血清中检出。随着人们对HBV给人体造成损害的认识的不断提高,各国学者为了弄清HBV致病机制、HBV基因结果和检测方法的研究进行了不懈的努力。检测方法的不断改进,也促进了医学检验的飞速发展,乙肝病毒抗原的检测由最开始的琼脂免疫扩散、对流电泳、间接血凝、反向间接血凝试验到如今的ELISA(酶免)技术、放射免疫技术、发光免疫技术以及PCR技术等。检测方法更加灵敏、简便、快捷、微量,结果更加准确可靠,特别是PCR技术的应用于临床,检测技术更是一个从量到质的飞跃。可直接检测人体内HBV的有无及在体内的含量,同时可监测治疗效果,但目前开展PCR技术受诸多因素的影响,一般实验室开展有一定的困难,而酶免方法简便、快速、准确、灵敏可靠,血中含量≥1ng/ml就能检测出。所以,作为乙肝两对半检测,酶免方法为更多医院所首选。乙肝两对半的检测,现已成为各大、小医院常规的检测项目,甚至包括一些乡镇卫生院及个体诊所。由于它的检测方法灵敏、简便、快捷、微量、结果准确可靠,并且可以人工判读结果,不需要特殊的仪器及设备,所以,对如何保证乙肝两对半检测的质量,使其具有较高的重复性、准确性和各实验室之间的结果有可比性,就有必要对乙肝两对半的试剂及在乙肝两对半检测过程中,实验室内各个环节进行质量监控。在这里谈谈个人看法(主要针对ELISA法),与检验同道共同磋商。在乙肝两对半的检测过程中,要保证乙肝两对半的检测质量,应注意从以下几方面进行质量监测。1室内环境质量控制1.1各种试剂的选用试剂是保证乙肝两对半检测结果准确性的最关键的环节,试剂质量的好坏,直接关系到检验结果的准确性和可靠性。虽然各医院使用的试剂都是各个生物制品厂生产的成套试剂,但由于各生物制品厂生产的成套试剂灵敏度(有1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml)和特异性有所不同,要保证乙肝两对半检测结果的准确性,在使用过程中不要经常更换厂家,选择一个信誉较高的厂家(知名厂家所生产的试剂盒是通过严格的检测,经过各大医院长期使用所确认),无论是重复性,还是准确性都较高,所检测的结果各实验室之间可比性、准确率和可靠性都较高。1.2检验仪质量监测直接向临检中心购买,乙肝两对半检测一般是一个定性试验,检测过程中使用参考品(一般用临界值血清作质控物),一是对试剂盒进行质量监测,二是对检验的整个过程进行质量监测,避免假阴、假阳性,并在每次实验时,必须同时作阴、阳性对照(一些条件较差的乡镇卫生院及个体诊所,为了节约成本往往省略不做),以保证检验结果的准确性。2按说明书加样血清标本应尽量避免溶血和细菌污染,以防过氧化物酶样物质造成的假阳性。标本应新鲜,40℃保存不宜超过5d,以免因标本中的IgG聚合导致本底加深,影响结果判断。注意从以下几方面进行质量控制。加样量的准确与否,直接关系到结果的准确性和可靠性,要保证加样量的准确性,必须要有一个加样准确的加样器(多数医院使用的是带弹簧的加样器),加样器有一个缺点,使用一定时间,或放置不当,或因生锈,弹簧失去一定弹性,均影响加样量的准确性,所以,每隔一定时间进行校正,以保证加样量的准确性。由于各生物制品厂生产的成套试剂盒均使用滴瓶,但滴瓶的口径各厂家也不太一致,虽然按使用说明书操作,每一滴相当于50μl加样量,但存在一定的误差,并且每个操作人员在滴液过程中,使用的角度不可能完全相同,因此,加样的多少也就不同,检测的结果存在误差也就较大,为保证检验质量及结果的准确性,建议各种试剂(包括阴、阳性血清、酶、底物、显色剂、终止液)加样前,充分混匀后,使用加样器进行加样。为了保证乙肝两对半检验结果的准确性,建议最好是一次性使用,但现在许多医院所使用的吸头都不是一次使用,大多反复多次使用,甚至一些条件差的乡镇医院或个体诊所,为了节约成本,一头多用(即用一个吸头将所有样品加完)。大家知道,一个高滴度的乙肝携带者的血清样本有时稀释成千上万倍后,检测结果仍然显阳性,如果吸头未冲洗干净,则可能造成下次标本出现假阳性结果。特别是一头多用,如果前一个患者是一个高滴度的乙肝携带者,吸头的残留液可能造成以后连续几个样品出现阳性,造成假阳性,使结果失真。如果条件有限,则必须将加样头用消毒液浸泡一定时间,反复冲洗后再煮沸消毒,烘干使用,使假阳性结果降到最低限度。严格按说明书加样完成后,孵育及显色时间、温度应严格按说明书进行,孵育及显色时间如果放置不够,将可能造成假阴性结果(主要是低滴度的样本),孵育温度不能过高、过低,应严格控制在37℃左右。过高,可能造成酶失活;过低,酶结合不充分,均可能造成假阴性结果。显色时间不能过长,放置过久,结果判读、比色时间应在30min内完成(大家知道,底物液和显色剂作用时间过久,因受空气中氧气的氧化作用后,均可能要出现颜色反应),否则,结果难以判断,可能出现假阳性。2.4最大缺点—洗板在乙肝两对半检测过程中,洗板时间、次数是非常重要的一个质量控制环节,在大多数县级以上医院都已使用自动洗板机。使用自动洗板机在洗板过程中,要防止堵孔:①洗板机内部结晶形成,特别是冬天,因此应经常对洗板机进行内部冲洗;②血浆纤维蛋白形成,在洗板过程中造成堵孔,洗板前对检测样品进行检查去除)。洗板完成后,有时仍有少量残留液(一般少于2μl),应在滤纸上充分拍干。酶标条放在酶标板上不要过高过低,避免洗板时吸液针卡板和吸液效果差,以保证检验质量。对多数乡镇医院及个体诊所来说,由于条件的限制,仍使用手工洗板,手工洗板的最大缺点就是冲洗量、速度及时间不易控制。大家知道,乙肝两对半检测本身是一个微量反应过程,冲洗不当(如量过多外溢,污染相邻样品孔造成交叉污染)也将造成假阳性或假阴性结果,为了保证乙肝两对半检测质量的准确性和可靠性,必须按说明书严格操作,并制定严格的洗板操作规程,使本实验室工作人员不因个人意愿操作,造成检验结果的不一致。应严格按说明书进行操作,不能根据自己的爱好,随意加大或减少配制浓度,洗涤液浓度过高,可能造成假阴性,洗涤液浓度过低,可能造成假阳性结果。每次使用完成后,加防尘罩,但由于在使用过程中,仪器的净电吸引作用,可使空气中的灰尘吸附在机器上,特别是附着在比色孔上,时间过久灰尘过多,光线不易通过滤光片,影响比色。所以,每隔一定时间要除尘,特别是比色孔。在我们平时的实验检测过程中,做定性测定的时侯,有时会遇到某些样品测得的OD值在Cutoff(临界值)附近区域(即灰区)可通过设定这个范围来确定灰区的大小和判定结果。灰区的大小是一个经验值,设置范围一般根据各地情况而定,一般设定在Cutoff(临界值)附近±10%的区域,如果定性结果落在灰区中,可建议过一段时间再来复查,以保证本实验室结果的准确性和可靠性。大家知道,酶容易失活,底物和显色剂受温度影响也较大,特别是在高温情况下,更是如此,在乡镇及个体诊所,由于标本量较小,药盒使用时间较长,在乙肝两对半加样完成后,应立即将药盒放回4℃～8℃冰箱保存,以尽量保证试剂质量和延长使用时间。综上所述,在乙肝两对半检测过程中,只要我们检验人员严格按照试剂盒操作说明去做,在整个实验操作过程中,每一环节按照以上几方面做好质量控制