地黄属6个物种的形态学及核核糖体内转录间隔区序列分析

地黄属6个物种的形态学及核核糖体内转录间隔区序列分析

共有6种黄土属植物，包括中药和外壁上。et.mey、ran.e.骨折、高黄色、湖北黄、罗伊叶黄、新疆黄、湖南黄、新疆黄、，再造林。其中除地黄分布达朝鲜半岛和日本之外,其余种均为中国特有植物。长期以来,关于地黄属植物的研究基本上局限于栽培药材地黄。在形态解剖学方面,肖玲等、王太霞等通过对地黄块根的形态发生和发育解剖学观察,证明其药用部分为块根而不是块茎;方瑾等对地黄花药超微结构进行了研究,证实地黄花药绒毡层具有二型性;王伏雄等记载了地黄花粉经醋酸酐处理后的形态在光学显微镜下为球形或椭球形。Pan等观察了地黄花部器官的形态发生过程。在细胞学方面,Ratter和Prentice报道了R.angulata(Oliver)Hemsl.(裂叶地黄的异名)染色体数目为2n=28条;龚维忠等分析了地黄的核型为2n=56=50m+2st(SAT)+4t,属2A型;温学森等分析了8个栽培地黄品种和2个野生地黄品种的染色体数目,表明栽培品种与野生品种在染色体倍性上并无区别。在分子系统学研究方面,陈京荔等对19个不同地黄品种进行了RAPD分析,发现北京系列的8个品种首先聚在一起,85-5系列的5个品种较早地聚在一起,表明各系列内具有较近的亲缘关系。武雯等报道了地黄属各物种的根、茎、叶均含有大量的梓醇成分。这些研究基本上都是围绕着R.glutinosa而开展的,极少涉及属内其它种类,更没有属内种间亲缘关系研究的报道。本研究针对地黄属全部物种,进行块根、茎、叶、花、果实和种子等器官的比较形态学及解剖学、细胞学研究,并进行核核糖体DNA内转录基因间区ITS的测序分析,以探讨地黄属种间亲缘关系,为我国特有的地黄属植物的深入研究和利用以及确定地黄属的系统学地位提供资料。1材料和方法1.1生物站湿地实验材料地黄(Rehmanniaglutinosa)、天目地黄(R.chingii)、高地黄(R.elata)、裂叶地黄(R.piasezkii)、湖北地黄(R.henryi)和茄叶地黄(R.solanifolia)均种植于华东师范大学生物站。1.2方法1.2.1观察方法及微形态观察对各物种的根、茎、叶、花、果实及种子进行形态解剖。其中根、茎、子房发育过程观察采用徒手切片法和常规石蜡切片法;花粉粒、种子微形态观察采用JXA840扫描电镜,对种子长度、种子宽度、外种皮网壁厚度、外种皮内侧网纹直径进行测量,并加以统计学分析;在植物培养室内播种,跟踪观察各物种发育过程中的叶形变化,并拍照记录。1.2.2常规染色体毒性检测选用小孢子母细胞减数分裂时期的花蕾作材料,预处理采用饱和对二氯苯溶液,处理时间为1～1.5h,按李懋学等的方法进行常规染色体制片,拍照记录各物种染色体数目。1.2.3系统树的构建采用CTAB法对植物总DNA进行提取,用通用引物ITS1和ITS4,按程序(94℃5min;94℃1min,55℃45s,72℃1min,30次循环;72℃5min)对完整的nrDNAITS片段进行PCR扩增。扩增产物回收纯化后进行双向测序,所有样品的测序均经过单向重复。用PAUP*4.0b8构建系统树。为了检测地黄属是否为单系起源,以Gentianastraminea(DQ317491)和Nicotianaobtusifolia(EF190038)为外类群,加入Antirrhinummajus(AY731280)、Buddlejamarrubiifolia(AF363671)、Digitalispurpurea(AY492102)、Gratiolaofficinalis(AY492106)、Oreosolenwattii(AF509817)、Picrorhizakurrooa(AF509813)、Sesamumindicum(AF169853)、Veronicalanosa(AY540868)、Calceolariatomentosa(AJ579446)等9个相关种作为内类群联合分析(括号内为GenBank中的登陆号)。2结果与分析2.1不同发育时期的叶形态及种子形态地黄属各物种在根、茎、叶、胎座、花粉粒等结构的解剖学上未见明显差别,但在形态学上,特别是在发育过程中叶形的变化、花冠的形态及种子的微形态等方面,均存在明显的差异(由于未获得茄叶地黄种子,故有关幼苗期叶形态和种子的研究暂未包括该种)。2.1.1克氏原螯虾群落木质部形态特征地黄属植物的鲜根为鲜黄色或淡黄色,圆柱形。栽培地黄的块根常显著膨大,茄叶地黄在较好的栽培条件下,根也呈结节状膨大,其余种及野生地黄的根细弱,无结节状膨大,直径不超过2.0cm。横切面上,各物种次生木质部导管均呈辐射状排列,每束通常1～3细胞宽,在径向呈二叉状分支。初生木质部导管与次生木质部导管直径略相等。皮层薄壁组织发达,细胞排列疏松,占横切面的2/3以上,有油细胞,部分细胞含黄色色素块。2.1.2初代地质结构各物种茎的形态结构基本一致,均为圆柱形,通常绿色,有时转变为红褐色,被白色多细胞长柔毛及腺毛。横切面上可见髓部发达,初生木质部导管呈单列细胞排列。但地黄和茄叶地黄的茎明显较其它种矮小,成年植株高度通常在50cm以内,天目地黄和湖北地黄的高度为中等,而裂叶地黄和高地黄成年植株高可达120cm以上。2.1.3叶不分裂类型在幼苗期,地黄的第1至第4片真叶均明显地长而窄,以此可以将它与其余种区分开来(图版Ⅰ,1～5)。自第5片真叶开始,叶形变化可分为不分裂和中下部显著分裂两类。天目地黄、地黄和茄叶地黄属于叶不分裂类型,其中天目地黄的叶形较大,叶缘形成不规则圆齿或粗锯齿,有时基部有具圆齿的极浅裂片;地黄的叶形较小,为长椭圆形,锯齿较规则,圆齿或粗锯齿,或为波状钝齿;茄叶地黄的叶为卵形或椭圆形,有规则的圆齿或粗锯齿。裂叶地黄、高地黄、湖北地黄的叶属于显著分裂类型,其差异体现在叶缘基部分裂程度的不同,湖北地黄的叶分裂较浅,不超过1/2,而裂叶地黄和高地黄的叶裂可深达3/4处(图版Ⅰ,6～11)。2.1.4侧膜胎座内突入圈内突。根据分子房内胎座的发育情况在各物种中表现基本一致。发育初期,横切面上可见2合生心皮呈一圆圈,随后子房室底部两侧腹缝线内突,形成侧膜胎座。侧膜胎座由下而上进一步向子房室中心扩展,使两侧胎座连接成一隔膜,近乎完全将子房分隔成2室,形成中轴胎座。发育后期,随着胚珠的发育、成熟,这一隔膜由上而下部分地解体,使果实中可见上部1室、下部2室的构造。2.1.5极面观的形状新鲜花粉扫描电镜观察表明:花粉粒的形态均为具三沟的长球形至超长球形,极面观为三裂圆形,沟狭窄,孔常不可见;网状雕纹明显,沟边、两极与赤道面处没有明显差别(图版Ⅰ,12、13)。属内差异主要表现在花粉粒大小及外壁网眼大小上,天目地黄花粉粒最大,裂叶地黄与高地黄的外壁网眼相对较大。2.1.6高年生物冠与高高等、断裂、缘冠的冠材花的形态特征在种间有不同程度的差别(图版Ⅱ,1～6)。地黄与茄叶地黄花冠较小,长度一般不超过4.5cm,花冠外面暗紫红,内面黄紫色,裂片逐渐变黄白色,花冠筒略向上弯或直,喉部略扩展。其余4种的花冠略大,长度均在5.0～7.0cm之间,其中高地黄与裂叶地黄的花冠呈鲜紫红色,下唇裂片基部及花冠筒前方内外两面均可见显著斑点,花冠筒弯曲,前方明显呈囊状,喉部扩展。天目地黄与湖北地黄花冠筒直,但天目地黄鲜紫红色,偶见乳白色,湖北地黄筒部淡黄紫色,裂片白色,其后方有一紫红色斑块,二者易于区别。2.1.7立地条件对3种主要种子形态指标的影响很多形态学研究表明,种子的微形态特征在属级水平与种级水平上具有重要的分类学意义。就地黄属种子的大多数形态指标而言,天目地黄和湖北地黄较一致,裂叶地黄和高地黄较一致(表1;图版Ⅱ,7～12)。而地黄较为特别,在种子长度、宽度上与天目地黄和湖北地黄接近,在外种皮内侧网纹直径上与裂叶地黄和高地黄接近,在外种皮网壁厚度上则是属内最薄的。2.2细胞染色体核型对6种地黄的小孢子母细胞减数分裂的观察表明,地黄和茄叶地黄的小孢子染色体数目为n=28条,即体细胞染色体数目2n=56,与龚维忠等在地黄体细胞中的观察结果一致,其余4种的小孢子染色体数目均为n=14,即体细胞染色体数目为2n=28(图版Ⅰ,14～19),与Ratter和Prentice在裂叶地黄体细胞的观察结果一致。表明地黄属内存在多倍体现象,地黄与茄叶地黄为属内四倍体物种,其余物种均为二倍体。所有物种的染色体均属于小型染色体,中部、近端部、端部着丝点不易辨认,用常规的制片方法难以得到准确的核型公式。2.3聚类分析方法依据上述地黄属植物形态解剖学、细胞学及植物化学的研究结果,以毛地黄(Digitalispurpurea)为参照,运用NTSYS-pc2.1软件作聚类分析(数量性状及编码矩阵见表2)。结果显示,该属植物被明显划分为3支,天目地黄与湖北地黄、裂叶地黄与高地黄、地黄与茄叶地黄分别聚在一起(图1)。2.4u2004系碱基序列的扩增从地黄属6个物种的叶片中提取的DNA,扩增出约650bp的核核糖体内转录间隔区序列(ITS1,5.8S和ITS2)及部分18S和26SrRNA基因序列,碱基序列见GenBank,登陆号为DQ0693139(天目地黄)、DQ069315(高地黄)、DQ069312(地黄)、DQ069316(裂叶地黄)、DQ069314(茄叶地黄)、DQ272447(湖北地黄)。6个种完整的ITS区碱基序列统计信息见表3。PAUP分析(搜索参数如下:heuristicsearch、100random-additionsequences,TBRbranchswaping。其中邻近法用靴带检验法10000replications来检验各节点的置信度,最大简约法用1000replications来检验各节点的置信度)得到的NJ及MP系统树(图2)均显示,地黄属为一个稳定的单系,分化为3支,高地黄与裂叶地黄构成1支,天目地黄与湖北地黄构成1支,属内四倍体物种地黄与茄叶地黄构成1支。同时可见地黄属可能与Sesamum、Buddleja和Oreosolen有较近的亲缘关系,为确定地黄属的系统学地位提供了信息。3结论3.1植物为单系起源依据ITS序列所构建的地黄属及相关属的NJ与MP系统发育树均显示,地黄属的6个物种独立构成一大支,得到了100%的支持率,证明地黄属植物为单系起源。同时,基于形态学、细胞学及植物化学性状的聚类分析结果也支持这一结论。3.2种间及丰富的现代聚类分析二倍体物种裂叶地黄及高地黄在形态学上极为相似,甚至无法区别。两者成年植株明显高于属内其它物种;叶片显著分裂;花冠筒形态及色斑与其它物种有显著区别;两者种子微形态极为相似并且是属内最轻最小的一类。尽管上述各特征均有一定幅度的变化,但高地黄形态变异幅度处于裂叶地黄的变异幅度以内,聚类分析显示二者间的相似系数近于1。同时,nrDNAITS区的序列分析显示两者间差异最小,二者成为一支的支持率均达到100%。据此认为,高地黄和裂叶地黄实为同一物种,应予归并。3.3天麻草地与湖北草地的形态差异基于ITS序列所构建的地黄属植物系统树中,天目地黄与湖北地黄成为一支.形态学上,两者花冠较长,花冠筒直,种子在属内最重、外种皮网壁最厚,易与其它物种区分.但天目地黄与湖北地黄之间也存在一些可识别的形态差异,如天目地黄的叶上部常不分裂,而湖北地黄的叶明显浅裂或半裂;天目地黄花冠呈鲜紫红色,而湖北地黄花冠筒部淡黄紫色,裂片花后白色.基于上述来自分子系统学、细胞学与形态学研究的证据,可以推断天目地黄与湖北地黄有较近的亲缘关系,它们是一对姐妹种.3.4