纳米电化学生物传感器的研究进展

纳米电化学生物传感器的研究进展

1传感器的分类及研究现状生物传感器通常由生物识别元件（biodi）和信号转换装置（transport）组成。生物识别单元具有特异性，能够获得极其高的灵敏度。信号源通常是一种独立的化学习动物或物理敏感元件，可以使用多种电、光学、热、电等原则。把分子识别功能基底同高灵敏的信号转换器件相结合,就构成多种多样、千变万化的生物传感器。生物传感器可按照生物特异性授予机制或信号转换模式分类。按被选生物化学受体的不同,可将生物传感器分为酶传感器、免疫传感器、组织传感器、微生物传感器和细胞传感器等。根据生物反应产生信息的物理或化学性质,信号转换器通常采用电化学、光谱、热、压电及表面声波等技术与之相匹配,而由此衍生出电化学生物传感器、光生物传感器、半导体生物传感器、热生物传感器和压电晶体生物传感器等。因为电化学转换器件具有较高的灵敏度,易微型化,能在浑浊的溶液中操作等许多优势,并且所需的仪器简单、便宜,因而被广泛应用于传感器的制备中。根据电化学检测的模式不同,又可具体分为安培型、电势型、表面电荷场致效应晶体管(FETs)型和电导型电化学生物传感器。生物传感器诞生在20世纪60年代,而对其研究的全面展开是在20世纪80年代。20多年来该领域发展迅速,取得了显著的成绩。随着人类基因组研究的深入进行和微纳米技术的普及与成熟,纳米传感器、基因芯片以及微全分析系统(TAS)等新器件、新系统的出现,把生物传感器的研究推进到一个崭新的发展阶段。本文主要综述纳米电化学生物传感器近年来的研究进展。2生物传感检测介质纳米电化学生物传感器是将纳米材料作为一种新型的生物传感介质,与特异性分子识别物质如酶、抗原/抗体、DNA等相结合,并以电化学信号为检测信号的分析器件。2.1纳米技术在生物传感检测元件稳定性的技术进步中多年来,生物传感器引起了人们的极大关注,相当多的公司与研究单位开展了生物传感器的研究与开发,相应的文章与专利也急剧增加。然而,目前成熟的商品化生物传感器还很少,且大多数处于小批试生产阶段,仅有少数品种已计划大规模生产。造成这种状况的主要原因之一在于生物识别元件的稳定性差,不能满足生物传感器长期持续检测的客观要求。发展新型材料和优秀的固定化方法则是提高生物识别元件稳定性的有效途径之一。20世纪90年代以来,纳米技术的介入为生物传感器的发展提供了新的活力,并已取得了突破性的进展。纳米材料由于比表面积大、表面反应活性高、表面原子配位不全等导致表面的活性位点增加、催化效率提高、吸附能力增强,为生物传感研究提供了新研究途径。与传统的传感器相比,新型纳米材料传感器不仅体积更小、速度更快、而且精度更高、可靠性更好。由于纳米粒子高的比表面积和其本身的生物兼容性,在生物电催化反应中起着重要作用。例如与纳米粒子组装后的酶,其活性中心可更接近电极表面,易于进行电子转移,提高了生物电催化活性,使其更有利于在电化学传感器中应用。2.2纳米粒子的特性纳米材料是指三维空间中至少有一维处于纳米尺度(1—100nm)范围内的材料或由它们作为基本单元组装而成的结构材料,包括金属、氧化物、无机化合物和有机化合物等。该尺寸处在原子、分子为代表的微观世界和宏观物体交界的过渡区域(介观体系),处于该尺寸的材料表现出许多既不同于微观粒子又不同于宏观物体的特性,突出表现为4大效应。(1)表面效应。指纳米粒子的表面原子数与总体原子数之比随粒径的变小而急剧增大,从而引起数与总体原子数性质上的突变。粒径到达10nm以下,表面原子数与总体原子数之比迅速增大,当粒径降至1nm时,表面原子数与总体原子数之比超过90%以上,原子几乎全部集中到粒子的表面,表面悬空键增多,化学活性增强。此时粒子的比表面积、表面能和表面结合能都发生很大的变化。(2)体积效应,亦称小尺寸效应。当纳米粒子的尺寸与传导电子的波长及超导态的相干长度等物理尺寸相当或更小时,周期性的边界条件将被破坏,熔点、磁性、光吸收、热阻、化学活性、催化性能等与普通粒子相比都有很大变化,这种特殊的现象通常称之为体积效应。该效应为其应用开拓了广阔的新领域。(3)量子尺寸效应。颗粒尺寸下降到一定值时,可将大块材料中连续的能带分裂成分立的能级,能级间的间距随颗粒尺寸减小而增大,这种现象称为量子尺寸效应。当热能、电场能或磁能比平均的能级间距还小时,就会呈现一系列与宏观物质截然不同的反常特性。(4)宏观量子隧道效应。隧道效应是基本的量子现象之一,即当微观粒子的总能量小于势垒高度时,该粒子仍能穿越这势垒。近来年,人们发现一些宏观量,例如微颗粒的磁化强度、量子干涉器件中的磁通量以及电荷等亦具有隧道效应,它们可以穿越宏观系统的势垒而产生变化,故称之为宏观的量子隧道效应。纳米粒子也具有这种贯穿势垒的能力。2.3传感器的组成从纳米材料在电化学生物传感器中的具体应用来看,纳米电化学生物传感器主要包括如下类型:纳米颗粒生物传感器,纳米管、纳米棒与纳米线生物传感器,纳米片以及纳米阵列生物传感器等。其中因为碳纳米管的优异性能,使得基于碳纳米管的电化学生物传感器发展极为迅速。2.3.1纳米颗粒作为催化剂的应用纳米颗粒在电化学生物传感器中的应用非常广泛。纳米粒子由于具有大的比表面积和很高的表面自由能,在吸附固定生物分子方面可以扮演重要的角色,用于生物分子的固定,可以增加固定的分子数量,从而增强反应信号。金溶胶纳米颗粒由于吸附生物大分子后仍能保留其生物活性,因而最初广泛用于电子显微镜中标记生物分子。自从Zhao等报告了葡萄糖氧化酶被固定在金溶胶上制备了高性能的葡萄糖传感器以来,研究表明,多种酶可以牢固地吸附在金纳米颗粒表面,并且能保留其催化活性。金纳米颗粒对氧化还原蛋白质在电极上起到定向作用,可以改变氧化还原蛋白质的微环境,并可作为固定化氧化还原蛋白质与电极之间有效的电子媒介体,从而使得酶的氧化还原中心与电极间通过纳米粒子进行直接电子转移成为可能。金溶胶逐渐被广泛用于固定化酶制备电化学生物传感器。目前已有多种纳米颗粒材料用于电化学生物传感器的制备。所用的纳米颗粒包括TiO2、Au、Ag、Pt、Pd以及SiO2等[23,24,25,26,27,28]。Tang等制备了憎水和亲水型的纳米二氧化硅及金颗粒,研究了不同颗粒的吸附性能和酶的活性之间的关系。他们发现不论何种类型的颗粒,在同样制备条件下酶的吸附量总是随着颗粒尺寸的降低而增加。Jena等把纳米金颗粒分散到二氧化硅溶胶凝胶网络中,形成了金纳米粒子修饰电极。该电极和脱氢酶组合成的电化学生物传感器,在低电位(-5mV)下对辅酶(NADH)的检测极限低至5nM,显示了极高的灵敏度。Neufeld等结合基因工程技术制备了全细胞的生物传感器,对基于细胞膜破坏类型的有毒化学物质,有极高的电流响应灵敏度,对苯酚的检测极限可达1.6ppm。侯宪全等采用纳米ZnO与聚乙烯醇缩丁醛(PVB)构成的复合膜基质来固定葡萄糖氧化酶(GOD),制成的葡萄糖生物传感器对葡萄糖响应的灵敏度大幅度提高。Zhao等在铂电极表面自组装憎水蛋白膜固定酶,制备了电流型葡萄糖传感器,其酶的利用效率得到很大提高。Jena等用L-乳酸脱氢酶、羟胺和金纳米粒子制作了对L-乳酸盐敏感的电流型生物传感器,该传感器具有灵敏度高、稳定性好、可多次重复使用的特点。Huang等将葡萄糖氧化酶吸附在硫化镉(CdS)纳米粒子上,研究了纳米粒子对葡萄糖氧化酶电子传递的促进作用。Bai等利用金纳米粒子和介孔二氧化硅复合材料固定酶,制备了高效的电流型葡萄糖传感器。Chandra等把纳米金颗粒负载到功能化的介孔交联聚合物之中,制备了可灵敏检测过氧化氢的修饰电极,该电极可以进一步发展为一系列的电化学生物传感器。纳米颗粒增强的电化学生物传感器的应用大大丰富了生物传感器的研究内容。然而对于纳米颗粒在这一体系之内所起的具体作用(例如究竟利用的是纳米材料4大效应中的哪些效应)还不是很清楚。本课题组针对这一问题也进行了一定的探讨。通过对一系列不同粒径的纳米颗粒修饰的葡萄糖生物传感器和不同厚度的纳米二氧化硅膜修饰的生物传感器的性能测试研究,发现对于非金属的纳米颗粒而言,提高传感器响应电流的途径可能仅仅是通过增加比表面从而提高酶的有效负载量来实现的。而对于含有金属纳米颗粒的电化学生物传感器,我们认为金属纳米颗粒的存在能够起到加速电极上电子传递过程的作用,从而改变电极反应规律。这与其他课题组的结论相符。核酸适配体(aptamers)是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列,能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合。它的出现为化学生物学界和生物医学界提供了一种新的高效快速识别的研究平台,并在许多方面展示了良好的应用前景。郑静等利用金纳米颗粒标记的核酸适配体以及被固定在磁性纳米颗粒上的核酸适配体与凝血酶蛋白同时结合形成磁性颗粒/凝血酶/纳米金胶的三明治结构,利用磁性分离,将金胶纳米颗粒特异性地吸着到电极表面,通过检测电极上金胶的电化学信号,实现对凝血酶靶蛋白的检测。这种生物传感器对凝血酶蛋白具有很高的特异性识别能力,其检测不受其他蛋白质如牛血清白蛋白等存在的干扰,可应用于实际血浆中凝血酶的检测。在量子点电化学生物传感器方面,Liu等利用碳纳米管和碲化镉量子点的协同效应研制了检测葡萄糖氧化酶的电化学生物传感器。该传感器可检测到峰形很好的葡萄糖氧化酶的氧化还原信号,与单独的碲化镉量子点或碳纳米管修饰电极相比,该生物传感器在灵敏度及稳定性方面均有显著改善。Jie等研究了水溶性CdS纳米晶的电致化学发光(ECL)。通过自组装与金纳米颗粒放大技术研制成一种新型的纳米量子点非标记型ECL生物传感器,具有重现性好、响应速度快和稳定性好等优点。该课题组还利用硒化镉纳米晶与碳纳米管复合制备了无标记的ECL免疫传感器,对人抗体的检测极限低至0.001ngml-1。虽然量子点与生物大分子共价结合后能实现超敏感的生物检测,但是因为量子点本身是一种有效的荧光标记物,所以量子点在电化学生物传感器中的应用不如在结合荧光分析类的传感器中应用广泛。Varshney等把抗体与磁性纳米粒子的组合体系与微电极阵列耦合在一起,制备了能够快速、特异检测食品中大肠杆菌的阻抗型传感器,对大肠杆菌的检测极限低至7.4×104CFUml-1。为了实现对单个细菌的检测,Lu等经由lift-off过程,把厚度为100nm的金膜制成微电极阵列,在该电极上固定抗体后可以实现对单个埃希氏菌的电流检测,并且可实现对细菌的现场监测。纳米颗粒修饰的生物传感器是最有发展前景的传感器之一。纳米颗粒种类多,制备和形貌控制方法较为完善,与不同的生物相容材料组合而成的修饰电极,在生物传感器领域必将发挥越来越大的作用。2.3.2纳米线传感器技术一维纳米材料中氧化锌纳米棒既具有高的表面能和良好的生物相容性,又有良好的电学和光学特性,其应用备受瞩目。Zhang等用气相沉积法制备了氧化锌纳米棒,并在其上直接固定尿酸氧化酶,构成了新型无电子媒介体的传感器,具有独特的热力学稳定性。长期以来,实现酶的活性中心和电极之间的直接电子转移一直是生物传感器领域一项重要的基础研究工作。Willner等利用共价结合在金电极上的吡咯喹啉苯醌(PQQ)单分子层制备了酶电极,PQQ作为分子导线在酶的活性中心和金电极之间传递电子。这可认为是纳米线传感器的早期形式之一。Rakitin等的研究发现锌、镍、钴等离子能够进入DNA双螺旋的中心,在一定条件下可以稳定DNA含有金属离子的状态,获得了导电的DNA电线。此类金属化的DNA仍然保持选择性结合其他分子的能力,利用该特点,可以开发各种遗传畸变探测生物传感器。Yi等利用硼掺杂硅纳米线(SiNWs),制作了一种基于电流测量的小型、快速、灵敏度高的实时检测生物和化学样品的传感器。Curreli等利用In2O3纳米线构造了一种可对靶点DNA检测的生物传感器。Hahm等利用p型Si纳米线制备了可对DNA进行检测的电化学DNA传感器,该传感器检测限可达到10fM。Sabahudin等通过电化学刻蚀和电化学共沉淀固定化酶,制备了单根纳米铂丝生物传感器,在对葡萄糖含量的检测中背景电流低于1×10-12A,响应时间仅为2s,检测下限达到20μM。此种传感器可用于监测单个细胞内的生物物质(如肾上腺素、复合胺等),可用于单细胞行为研究和生理学研究。由于纳米线材料的广泛应用前景,相关研究工作还在不断推进之中。2.3.3电化学生物传感器碳纳米管(CNT)所表现出的许多优良的物理性能使得对CNT修饰材料的研究成为目前电化学生物传感器领域备受关注的前沿课题之一。但是,CNT是由成千上万处于芳香不定域系统中的碳原子组成的大分子,几乎不溶于任何溶剂,而且在溶液中容易聚集成束,这就限制了对其化学性质方面的研究,也难于将它纳入生物体系,大大限制了CNT在各方面的应用。许多研究工作就是从改进碳管的溶解性开始的。把碳纳米管分散于Nafion、壳聚糖等高聚物的溶液中修饰玻碳电极制备的生物传感器,可大大提高了传感器的响应灵敏度和抗干扰能力。Wang等首先把碳纳米管分散到Nafion溶液中,制备了抗干扰能力突出的电流型生物传感器。Hrapovic等把碳纳米管分散到Nafion溶液中,与直径为2—3nm的铂纳米颗粒复合之后修饰玻碳电极,制备了电化学葡萄糖传感器。这种GC/CNT/Ptnano/GOx传感器对葡萄糖具有很高的响应速度和灵敏度,在0.5μM—5mM葡萄糖浓度范围内具有线性响应关系,灵敏度高达2.11μA·mM-1,检测极限可达0.5μM。Zhang等把碳纳米管分散到壳聚糖溶液中,得到了一个具有良好生物相容性的制备生物传感器的平台。Liu等在壳聚糖-碳纳米管体系中固定葡萄糖氧化酶,观察到了酶和电极之间直接电子转移的证据,得到了具有良好性能的葡萄糖传感器。张凌燕等利用层层组装技术,将多壁碳纳米管/辣根过氧化物酶/纳米金固定在玻碳电极表面,制得了灵敏度高、稳定性好的过氧化氢生物传感器。段大雪等借助碳纳米管以及铂纳米颗粒制备了检测葡萄糖的生物传感器,该传感器稳定性好、响应速度快。Zeng等用多氨基枝状化合物修饰多壁碳纳米管,制备了高效的葡萄糖生物传感器。该课题组还把亚铁氰化钴与碳纳米管和壳聚糖组装起来,利用碳纳米管极佳的电子转移能力,大大提高了亚铁氰化钴的氧化还原活性,制备的葡萄糖生物传感器可以在-0.2V电压下工作,避免了溶液中电活性物质的干扰。Manesh等采用静电纺丝的方法,把包裹了多壁碳纳米管的聚阳离子电解质(PDDA)和聚甲基丙烯酸甲酯制成纳米纤维膜,在膜上固定葡萄糖氧化酶得到了一种新型的葡萄糖传感器,具有很宽的线性范围和良好的选择性、稳定性及重复使用性能。本课题组把碳纳米管分散到β-环糊精聚合物中,也得到了稳定的葡萄糖生物传感器。纳米碳纤维具有和碳纳米管相似的机械强度和电学性能,也被广泛用于电化学生物传感器的制备。Huang等利用静电纺丝技术和热处理过程把钯纳米颗粒负载到碳纳米纤维上。该复合体系经由电化学阻抗谱和循环伏安法证实具有很高的导电能力,并大大加快了电子转移速率,所制备的过氧化氢传感器在-0.2V工作电压下检测极限低至0.2μM。2.3.4电化学传感器Miao等利用化学和电化学方法使吡咯单体在模板孔隙中生长,得到了与模板相应结构的聚吡咯微管。这种微管具有较大的比表面积,能容纳大量的酶分子,并减少反应物和产物的扩散障碍,有效地提高了酶电极的性能。Yang等利用电沉积的方法在聚碳酸酯模板上制备了铂纳米阵列,铂纳米电极密度为5×108cm-2,所制备的葡萄糖传感器线性范围非常宽。Chang等利用氧化铝模板制备了导电聚苯胺纳米管阵列,并把低聚核苷酸探针共价结合到管上,得到了具有极高灵敏度的电化学DNA传感器,对低聚核苷酸的检测极限低至1.0fM。与上述阵列间距可控程度较差的纳米阵列传感器不同,Lin等在镀铬的硅衬底上电沉积纳米镍粒子,用等离子体增强化学气相沉积技