异质性耐万古霉素葡萄球菌的倍稀释法测定

异质性耐万古霉素葡萄球菌的倍稀释法测定

医院内抗甲氧西林细菌感染，治疗困难，死亡率高。万古霉的治疗效果并不理想，但万古霉无法临床分离。现在，许多研究认为，这可能与万古霉的异质性抗剂有关。异质性抗剂约10-6的菌株对万古霉素有抗性，它们的传代培养非常有效。万古霉素对这种细菌没有影响，但可以诱导细菌对万古霉素的异质性抗剂。因此，有效的药物过敏鉴定方法对选择这些植物，合理使用万古霉素具有重要意义。1材料和方法1.1菌株鉴定及药敏试验应用菌群分析方法从115株葡萄球菌中筛选出9株葡萄球菌对万古霉素耐药亚群在10-6以上(MIC>8mg/L),6株为溶血性葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)[即MRSH109,MRSH2,MRSH13,MRSH31,MRSH60,MRSH108],3株金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)MRSA73,MRSA98,MRSA102。传代培养其MIC≥16～32mg/L,为万古霉素异质性耐药株。金黄色葡萄球菌标准株ATCC29213、ATCC25923作为质控菌。1.2瑞典abbiodisk公司万古霉素E-test试条(0.16μg～256μg,瑞典ABBioDisk公司),万古霉素纸片(30μg,英国Oxoid)。脑心浸液琼脂(BHIA,英国Oxoid)。1.3万古霉素初代物测定从含有8～16mg/L万古霉素的BHIA平板中挑取新鲜的万古霉素异质性耐药葡萄球菌菌落4～5个,接种于4～5ml的脑心浸液中,35℃孵育4～6h,用生理盐水调制成McFarland0.5管(约108CFU/ml),取灭菌棉浸蘸菌液,涂布接种于直径90mm的BHIA平板表面,静置5min,待平板表面水分吸收后,贴万古霉素纸片和E-test拭条。35℃孵育48h观察结果,纸片法:敏感≥15mm,无耐药界值标准。万古霉素MIC界值标准:敏感≤4mg/L,中介8～16mg/L,耐药≥32mg/L(参照NCCLS)。1.4生长曲线测定万古霉素水生霉的测定对倍稀释的万古霉素药液(0.125～64μg/ml)加入直径90mm的平板,约25mlBHIA灭菌培养基倒入上述万古霉素平板中混匀,凝固后置温箱约1h,多点接种仪取上述菌液约1μl(104CFU)接种,35℃孵育48h观察结果,判断标准同E-test。2结果2.1s13、mrsa102的mic扩增E-test法测得MRSH109、MRSH108、MRSH2、MRSH13、MRSH31、MRSH60、MRSA97、MRSA73、MRSA102的MIC依次为:16、32、24、48、48、16、24,24、32mg/L,其中耐药7株占77.8%(7/9),中介2株占22.2%(2/9);琼脂稀释法测得对万古霉素的MIC为:16、32、32、64、32、16、16、32、32mg/L,耐药6株占66.7%(6/9),中介3株占33.3%(3/9),药敏结果接近于E-test(Tab.1)。2.2敏感试验株及测定mic的鉴定万古霉素纸片对9株菌的抑菌圈直径依次为:14、12、10、11、10、15、10、13、13mm,其中中介4株占44.4%(4/9),敏感5株占55.6%(5/9),依据1999年NCCLS标准1株敏感(抑菌直径15mm),有无耐药不能界定,必须测定MIC。见Tab.2。2.3e-tor-pcr法纸片扩散法测得对万古霉素的敏感率为11.1%,不能界定有无耐药。E-test和琼脂稀释法无1株敏感,并且中介率和耐药率彼此接近耐药率分别达到77.8%和66.7%。见Tab.3。3万古霉素的mic检测万古霉素异质性耐药葡萄球菌亲本株对万古霉素不敏感或敏感性下降,并不呈现明显耐药,但随着与万古霉素接触,万古霉素异质性耐药亚群逐渐被筛选出来,最终导致万古霉素治疗的失败。万古霉素异质性耐药葡萄球菌明显受营养条件的影响,尤其脑心浸液(BHI)具有较好的诱导出万古霉素异质性耐药葡萄球菌,并能提高对万古霉素的最低抑菌浓度,日本花木秀明研究发现:MHA加上20%马血清以及BHI对万古霉素异质性耐药株Mu3的MIC较单独MHA要高1倍,而标准株ATCC29213对万古霉素的MIC却不受营养条件的影响均为1μg/ml,我们选用良好营养的脑心浸液琼脂来探讨目前较为常用的纸片法对筛选万古霉素异质性耐药葡萄球菌的影响,在含有≥8μg/ml万古霉素的BHI平板上挑取菌落,比较三种药敏检测方法对万古霉素敏感性差异,发现E-test和琼脂稀释法无1株敏感,并且中介率和耐药率彼此符合,耐药率分别达到77.8%和66.7%;而纸片扩散法测得对万古霉素的敏感率为11.1%,不能界定有无耐药株。提示E-test用来检测万古霉素异质性耐药株与经典的琼脂稀释法有较好的重复性,纸片法检测的结果无法有效检出耐药株。当进行大规模耐药监测时,有可能造成万古霉素异质性耐药株的漏检。同时发现应用纸片法抑菌圈直径大小难以判断万古霉素耐药,纸片扩散法不能识别对万古霉素MIC8μg/ml的MRS,近期亦主张用含有5μg/ml的万古霉素的MHA商用平板具有较好的稳定性,不过其营养条件差可能导致万古霉素异质性耐药株的漏检。1999年NCCLS规定MRS对万古霉素肉汤稀释法的MIC同前,但纸片法已作重大调整,取消用抑菌圈直径是否耐药和中介,同时将万古霉素敏感的直径提高至15mm(1997年以前为12mm),如果直径低于15mm必须以肉汤稀释法进一步测定其MIC。本文纸片法