怀山药种质资源的包埋玻璃化超低温保存与植株再生

怀山药种质资源的包埋玻璃化超低温保存与植株再生

甘薯是科的一种多壳类药物。它是中国道教和著名的四大经典之一，主要产于河南省文县、武港和沁阳。怀山药药食兼优具有降糖降脂、增强人体免疫力及抗衰老等功能,素有“怀参”之称,其产品畅销国内外。目前,传统的山药种质资源保存仍采用大田种植的方法,不仅需要大量的人力、物力和财力,而且还不可避免地受到各种自然灾害(如病虫害、干旱、低温等)和人为失误(疏于管理、挂错标签等)的影响,最终可能造成特有种质的遗失或混杂。因此,探索怀山药种质资源离体保存的方法具有十分重要的意义。包埋玻璃化超低温保存是20世纪90年代中期兴起的一种新的超低温保存技术(Matsumotoetal.1995)。该技术兼具玻璃化和包埋脱水超低温保存的优点,具有对材料的毒害性小、所需设备简单、易于操作、脱水时间短、恢复生长快等优点,在植物种质资源保存上显示出巨大的应用潜力(吴雪梅和汤浩茹2005)。目前该技术已应用于苹果(Malusdomestica)(Pauletal.,2000)、枳橙(Poncirustrifoliate)(Wangeal.,2002)、甘薯(Ipomoeabatatas)(HiraiandSakai,2003)、非洲紫罗兰(Saintpaulialonantha)(Mogesetal.,2004)、葡萄(Vitisspp.)(Wangetal.,2004)、悬钩子(Rubusidaeus)(Wangetal.,2005)、怀地黄(Rehmaniaglutinosa)(李明军等,2008)、铁皮石斛(Dendrobiumcandidum)和黄独(Dioscoreabulbifera)(YinandHong,2009,2010)等植物上。近年来,本实验室对怀山药种质玻璃化超低温保存进行了系统的研究(李明军等,2006;Lietal.,2009),在此基础上又进一步探索包埋玻璃化超低温保存技术及应用,旨在为怀山药种质资源的离体保存提供一条新的途径。1材料和方法1.1培养细胞的基因型供试材料为铁棍山药(Dioscoreaopposita‘Tiegun’)、太谷山药(D.opposita‘Taigu’)、怀庆1号山药(D.opposita‘HuaiqingNo.1’)和B号山药(D.opposita‘No.B’)4种基因型怀山药继代培养60天的试管苗。1.2方法1.2.1低温疲劳怀山药试管苗于低温下分别炼苗0、3、5、7、15和30天。1.2.2ms/ms培养基在无菌条件下,切取带芽茎段,放入含MS+0.1mol·L–1蔗糖(Suc)+0.1mol·L–1甘油(Gly)培养基中,低温下预培养3天。1.2.3有效包埋moll–1suc的ms培养基将材料切成2mm左右的带芽茎段,室温下与含3%海藻酸钠和0.2mol·L–1Suc的MS培养基混合,将混合液滴入含有0.5mol·L–1CaCl2和0.2mol·L–1Suc的MS培养基中进行包埋,获得球形包埋珠。每个包埋珠含1个材料。1.2.4moll–1mol-1工艺-1,8-1-甲基-1,8.2,5.2,5.2,5.2,5.2,5.2,5.2,5.2,5.2,5.2,5.2,7,5.2,7,5,7,7,7,5.2,4.3,4.2,4.3,4.2,4.2,4.2,4.2,4.3,4.4,7,5.2,4.4,5.2,4.4,5.4,5.2-二甲基亚7.2,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.将包埋珠分别放入3种不同的装载液中,装载液配比分别为MS+0.2mol·L–1Suc+2mol·L–1Gly、MS+0.2mol·L–1Suc+2mol·L–1Gly+30g·L–1甘露醇(Man)和MS+0.2mol·L–1Suc+2mol·L–1Gly+50g·L–1二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)。于0°C下装载60分钟。1.2.5乙二醇eg的脱水用玻璃化保护剂(30%Gly+15%乙二醇(EG)+10%DMSO+15%聚乙二醇(PEG)+0.4mol·L–1Suc)在0°C下脱水60分钟。1.2.6冷冻保存每10个处理过的包埋珠放入1个冻存管中,滴加新的玻璃化保护剂,然后将冻存管迅速置于液氮中保存24小时。1.2.7水浴中化冻从液氮中取出冻存管,分别放入温度为37°C、38°C、40°C和42°C的水浴中化冻,化冻时间为1–3分钟。解冻后,用含0.5mol·L–1Suc的洗涤液洗涤包埋珠2次每次洗涤10分钟。1.2.8培养时间及温度将包埋珠转入再生培养基(MS+2mg·L–1KT+0.02mg·L–1NAA)中,先暗培养14天,再转到光下培养。培养温度为(25±2)°C,光照时间为每天14小时。记录成活率及恢复生长的时间。成活率=(包埋玻璃化超低温保存后成活的茎段数)/(保存的总茎段数)×100%。1.2.9实验数据和标准差本实验设计为单因子实验。每次处理25个带芽茎段实验重复3次。实验数据用平均值±标准差表示。采用Excel和SPSS11.5软件进行方差分析。与对照比较采用t检验和F检验,多重比较采用LSD法检验。2结果与讨论2.1低温锻炼时间从表1可以看出,经过一定时间的低温锻炼,成活率有显著提高。低温锻炼时间较短时,随着低温锻炼时间的延长,成活率逐渐增高。低温锻炼时间为7天时成活率达到最大值。超过7天,成活率基本保持不变虽稍有下降,但未达到显著水平。可见,适当的低温锻炼有利于提高超低温保存后材料的成活率。2.2u3000u3000l从表2可以看出,装载液成分显著影响保存材料的成活率。用配比为MS+0.2mol·L–1Suc+2mol·L–1Gly+50g·L–1DMSO的装载液装载,成活率最高;而用配比为MS+0.2mol·L–1Suc+2mol·L–1Gly和MS+0.2mol·L–1Suc+2mol·L–1Gly+30g·L–1Man的装载液装载,成活率较低且效果相似。2.3化冻温度对材料成活率的影响从表3可以看出,化冻温度显著影响超低温保存后材料的成活率。随着化冻温度的提高,冻存后材料的成活率也有显著提高。其中化冻温度为40°C时,成活率达到最高值。低于或高于40°C时,成活率均下降。2.4铁认为不同基因型间的成活率不同不同基因型怀山药经包埋玻璃化超低温保存后均能获得再生植株,但成活率因基因型而异(表4),且不同基因型之间差异显著。铁棍山药的成活率最高,达64.29%;怀庆1号山药的成活率最低,仅13.11%。图1显示超低温保存后的铁棍山药带芽茎段在再生培养基上的萌发(图1A)和再生植株的形成(图1B)。2.5不同基因型的怀山药压包埋玻璃化超低温保存材料的成活率低温锻炼时间对包埋玻璃化超低温保存后材料的成活率有重要影响。在苹果茎尖超低温保存中发现,随着低温锻炼时间的延长,成活率增加,但4周之后成活率基本保持不变(刘云国和王晓云,2002)。本研究也发现随着低温锻炼时间的延长,怀山药带芽茎段包埋玻璃化超低温保存后的成活率也逐渐升高,7天时成活率达到最高,之后基本保持不变。这可能与低温锻炼提高了植物体内脯氨酸和多胺的含量以及胞液的渗透势,从而增加了植物的抗冻性有关。装载时用较低浓度的玻璃化保护剂浸润细胞,可促进玻璃化保护剂的渗透效果,并能防止将细胞直接投入高浓度的玻璃化保护剂时造成的渗透伤害。但装载液的成分和浓度因植物材料而异。例如铁皮石斛的类原球茎包埋玻璃化超低温保存时用MS+1mol·L–1Suc+2mol·L–1Gly作为其装载液(YinandHong,2009);悬钩子茎尖包埋玻璃化超低温保存中选用MS+0.8mol·L–1Suc+2mol·L–1Gly作为其装载液(Wangetal.,2005)。本实验以MS+0.2mol·L–1Suc+2mol·L–1Gly+50g·L–1DMSO作为装载液,可极显著提高材料的成活率。化冻方式是超低温保存技术的关键,贮藏于液氮中的样品,缓慢升温时细胞内会再次结冰,其温度危险区域大概在–50–10°C。因此,在解冻时须迅速通过此温度区域,避免细胞再次结冰而造成伤害。长春花(Catharanthusroseus)胚性悬浮细胞超低温保存后在37°C化冻1.5分钟效果最好(Fatimaetal.,2009)。塞尔维亚云杉(Piceaomorika)胚性组织超低温保存后在42°C化冻2分钟成活率达到最高(HazubskaPrzybyetal.,2010)。本研究结果表