elisa法常见影响因素的分析

elisa法常见影响因素的分析

临床上，酶联免疫吸附仪（elisa）的操作相对简单，但影响因素多。在实际工作中,经常遇到诸如背景太深的“花板”现象,而导致结果判读错误,产生一定的假阳性和假阴性,导致临床上出现误诊漏诊。我们对ELISA的常见影响因素作如下分析。1非特异性干扰物质患者体内若存在类风湿因子、补体、甲胎蛋白、嗜异性抗体等非特异性干扰物质,可与固相一抗、酶标记二抗Fc段结合而可干扰测定,导致夹心法ELISA假阳性。2elisa法标准的假设阴血药检验试剂质量是影响ELISA法检验结果的关键因素。抗原抗体纯度、亲和力、浓度、特异性、稳定性、重复性等均可影响测定结果。阴性对照品质量影响测定结果,由于双抗体(原)夹心法S/CO.=样品吸光度/(阴性对照吸光度×2.1),故阴性对照吸光度越高,可导致双抗夹心法(如HBsAg、HBsAb、HBeAg等)假阴性,而使竞争抑制法呈假阳性。中和抗原的浓度也可影响检验结果,一般其浓度过高,假阴性增多。此外,标记抗原或抗体所用酶的比活性也影响ELISA法的灵敏度。酶的比活性下降,灵敏度随之降低。对于高浓度的样本,加入终止液(硫酸)后黄色很快变为黄绿色,而导致吸光度下降,主要因为终止液浓度不够高所致。3血清标本hbsag测定血清标本应尽量避免溶血。因为溶血产生的血红蛋白分子中的亚铁血红素具有过氧化物酶活性,结合在微孔上包被的抗体,若在洗涤过程未能完全洗脱造成残留,最后可催化四甲基联苯胺(TMB)底物显色,可出现假阳性(如HBsAg测定)。标本若不能及时检测,应分离血清。4℃下可保存5d,若1周后检测则应在-20℃冷冻保存。血清标本受保存时间影响的主要因素是细菌污染,并且随着细菌数的增加,S/CO.变化增大。此外,细菌可产生菌体内源性辣根过氧化物酶活性的物质,能催化底物显色而干扰检测结果;若标本储存时间过长,抗原或抗体免疫活性下降也可影响检测结果。血液标本应该待凝固后再离心分离,避免纤维蛋白导致假阳性结果。若遇到高浓度的血清标本,应改用两步法ELISA试剂,若只有一步法ELISA试剂,则须对血清做一定的稀释,以避免“钩状效应”造成假阴性或使强阳性变为弱阳性。4操作技术因素4.1减少污染和减少重复使用的措施加样时应将样品加在微孔底部,以减少管壁对样品的吸附。此外,加样用的吸头避免重复使用,以免造成交叉污染。加样时避免吸到血细胞和纤维蛋白凝块。4.2加酶液孔壁或加酶液孔间隙的影响滴加酶标记抗原或抗体时要注意量的准确性,若多加酶1滴(50μl)或将酶液加在孔壁或孔间隙,会对影响测定结果,尤其对竞争法影响较大。4.3采用水浴法和孵箱法更稳定性更小孵育方法主要分为水浴法和孵箱法。研究表明,水浴法较孵箱法更稳定,边缘效应更小。建议临床实验室采用水浴法。孵育时间要严格控制,因为反应时间的长短会影响结果。4.4hba和hbcab应用全自动洗板机时应按照说明书设定最佳加注量、浸泡时间和洗板次数,浸泡时间过长或洗板次数过多,会导致显色减弱,一方面,可使双抗体(原)夹心法(如HBsAg)由强阳性变为弱阳性,甚至假阴性。另一方面,可使竞争法测HBeAb、HbcAb呈假阳性。反之,洗板次数不够,可导致“花板现象”,影响结果判读。洗板时要实时监控洗板机是否正常工作。若洗板时发生堵针,则游离酶液或非特异性物质吸附在微孔上未洗脱,造成假阳性或假阴性结果。为了避免管壁上游离酶液或非特异性吸附的蛋白残留,建议再手工洗板1次,浸泡时间为0.5～1min为宜。洗板后尽量拍干排出微孔内液体,孔内残留液一般不超过2μl。4.5显色反应造成错误结果加底物时也要注意加入量的准确性。A、B底物多加1滴对显色的深浅会造成影响。若漏加A、B底物中任何一种,则不会发生显色反应,造成错误的结果。值得注意的是,加底物后显色反应的温度和时间对结果影响很大。温度对酶促反应有双重影响,一方面,温度升高使反应加速;另一方面,温度升高,酶容易变性失活。温度一般选择37℃为宜。在一定时间内,反应时间延长,阳性孔显色会加深。故应按照说明书严格控制显色时间和温度。达到规定时间,立即加入终止液。4.6光干扰、比色加入终止液后,应混匀后尽快用酶标仪进行比色,建议采用双波长法测读,可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。终止反应后比色一般不能超过30min。时间过长,夹心法容易