细胞染色专题

细胞染色专题之一:台盼蓝台盼蓝（TiypanBlue,也称Directblue14一种死细胞染色用色素化学名：3,3,-{[3,3'-Dimethyl（l,r-biphenyl-4,4,-diyl]bis（azo}bis（5-aniuio-4-hvdioxy-2,7-naphthalenedisulfonicacid,tetrasodiumsalt3,3'-{[3,3'-二甲基-（1,1'-二苯基-4,4'-二基]双（偶氮卜双（5-氨基-4-短基-2,7碌二磺酸,四钠盐分子式:C34H24N6Na4O14S4分子量【960.81CASNumber:72-57-1外观「黑褐色结晶粉末摩尔吸光度:>69,000（在606nm附近染色原理：细胞损伤或死亡时,台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合,使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。这被称为染料排除测试（dveexclusion,EiytluosmB（红色、negrosineseosmY、AO和EB也用于此目的。通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。溶于水，可以配制成10mg/ml的水溶液，水溶液呈深蓝色。台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时，细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟，在显微镜下观察即可。应用于细胞凋亡:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞、细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整•细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。尽管在凋亡的早期到中期检测是很困难的，此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。储存条件「常温保存注意事项：台盼蓝对人体有毒台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色,会干扰计数。台盼蓝染色法对于悬浮细胞来说，还比较方便、对贴壁细胞来说，较为繁琐。因为要消化，有时,96孔板不一定能消化干净。而且,该法是测定细胞浓度的方法，与细胞悬液的体积有关、加入的胰蛋白酶或1640要计入终体积。可以说，该法相对准确，可能有一些人为因素的干扰。细胞染色专题之二］美蓝美蓝英文名:Methyleneblue,Swissblue中文名:亚甲基蓝、次甲基蓝、品蓝、美蓝、亚甲蓝、四甲基蓝、盐基湖蓝、碱性亚甲天蓝等。分子式:C16H18C1N3S分子量:319.85g/molCASNunibei:61-73-4EINECSNiunbe匸200-515-2熔点：100°C沸点「分解吸收峰:668mn和609mno染色原理：美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型、而对代谢作用微弱或死细胞,无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。细胞染色专题之三汨仆定橙口丫卩定橙:N,N,N',N'-tetrainetliylacndine-3,6-diannne中文名36-双（二甲基氨基口丫卩定英文名AcndmeOrange（AO,Eucluysme,3,6-Acnduiedianiuie,WaxolineOrangeA,AcridineOrangeBase,SolventOrange15,RliodulineOrange,RliodulineOrangeN,AcridineOrangeNO,RliodulineOrangeNO.BasicOrange分子式C17H19N3分子量【265.35g/molCASnunibe匸10127-02-3外观:橙色、红棕色粉末染色原理：口丫卩定橙（AO与双链DNA形成发绿色荧光的复合物。AO还可与单链DAN或RNA形成发红色荧光的复合物。一个AO分子嵌入双链DNA的三个碱基对并发出最大波长为526nm（激发502mn的绿色荧光。一个AO分子与单链DNA或RNA的—个磷酸基相互作用形成聚集或堆叠的结构，此结构发出最大波长为6501U11（激发460mii的红色荧光。因此,AO用于被利用来检测双链DNA和单链DNA或RNA。它使得用氮激光激发器或流式细胞仪同时测定DNA和RNA成为可能。光谱数据:与DNA作用时和荧光素相似，激发最大波长5021UH,发射最大525nm（绿光。于RNA作用时，激发最大波长移动到460nm（蓝光，发射最大移动到650nm（红光。染色程序：用PBS或合适缓冲液制备10-50PMAO溶液。a将1/10细胞培养基体积的AO溶液加入细胞培养基中。b3.37°C下孵育细胞10-20分钟。用PBS或合适缓冲液洗涤细胞2次。用带有500nm激发和530mn发射滤光片的荧光显微镜观察细胞。a由于AO可能具有致癌性，因此操作过程中须格外小心。b可以用1/10浓度的AO缓冲液代替培养基。储存条件:避光，冷藏保存细胞染色专题之四［碘化丙卩定碘化丙D定英文名Hopidiumiodide,Propidiumdiiodide;PI分子式:C27H34I2N4分子量:668.39外观:红棕色粉末应用QNA染色染色原理：碘化丙唳（PI是一种漠化乙唳的类似物,它在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光化合物一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。光谱性质PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为5351U11和615nm。染色过程：用PBS或适当的缓冲液制备10〜50pM的PI溶液。a将1/10培养基体积的PI溶液加入到细胞培养基中。b在37°C培养细胞10-20分钟。用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。用535mn激发波长,615nm发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。a由于PI可能具有致癌性、请小心操作。b也可以用1/10浓度的PI缓冲液代替培养基。保存条件：4°C避光保存对人体有刺激性，请注意适当防护细胞染色专题之五】罗丹明123罗丹明123【Rhodamine123分子式:C21H17C1N2O3分子量「381外观「橙红色、红棕色固体/粉末溶解性】可溶于DMSOCASNumbe匸62669-70-9染色原理：Rli123是一种细胞通透性的、阳离子的荧光探针，容易被有活性的线粒体摄取、没有细胞毒性。R11123透过细胞膜在活细胞的线粒体内聚集•发出黄绿色荧光，可用于对许多种细胞进行染色、包括植物细胞和细菌。由于细胞内ATP的量与R11123的荧光强度之间有相关性，此化合物被应用于检测细胞内的ATPOR11123还用于癌症研究。光谱性质：lex\lem(MeOH=505nm\534nm.e(505mil,MeOH=97,000.染色步骤:将0.4mgR11123溶解到1mlDMSO中制备成ImMR11123-DMSO溶液。用载玻片准备细胞。细胞数目应为5xl0e4-5xl0e5个/ml。孵育该载玻片，用PBS或Hank's液洗涤细胞。用培养基稀释lmMRhl23溶液以制备l-20|.iMR11123缓冲液。将R11123缓冲液a加入载玻片并在37°C下孵育30分钟至1小时。去除R11123缓冲液并用培养基洗涤细胞。b用带有荧光素滤光片的荧光显微镜观察细胞。a加入细胞前将R11123缓冲液放在37°C下孵育。b洗涤细胞后为了固定，加入10%福尔马林缓冲液并孵育15-20分钟,接着用PBS洗涤。储存条件:避光冷藏保存细胞染色专题之六刁臭乙锭；臭乙Ethidiumbromide化学名「渙化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基啡唳:2,7-Diannno-10-etliyl-6-plienylphenanthiidimunibromide,2,7-Diamino-10-etliyl-9-piienylphenantlHidinninibionude,3,8-Dianiuio-l-ethvl-6-phenylplienantiiduiiunibromide,3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylplienantlnidiniunibronude,Honudiunibiomide,EB,EtBi别名:胡漠胺3臭乙胺菲卩定;渙乙菲卩定分子式:C21H20B1N3分子量】394.31g/molCASnunibe匸1239-45-8熔点〔260-262°C(fiomwiki性质:从酒精中结晶的是具苦味的深红晶体.熔点238〜240°C;20°C时溶于20份水和750份氯仿。染色原理：EB不能穿过活细胞的细胞膜、然而可以通过死细胞破损的细胞膜而对细胞核DNA染色。EB含有一个可以嵌入的堆积碱基之间的一个平面基团,这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，由于EB-DNA复合物的荧光产率远大于未结合染料的荧光产率,所以当电泳凝胶中含有游离EB时，也可检测出少量DNA。它是一种高灵敏的荧光试剂，也是一种重要的荧光染料，常用于检测DNA和RNA0EB与DNA结合后抑制DNA的复制和转录。光谱性质:EB-DNA复合物的激发波长和发射波长分别为518mn和605nm。染色过程：用PBS或合适的缓冲液制备10-50|.iMEB溶液。a将1/10培养基体积的EB溶液加入细胞培养基中。b3.37°C下孵育细胞10-20分钟。用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。用带有515mn激发波长和600nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。a由于EB可能有致癌性，操作时须十分小心。b可以用1/10浓度的EB缓冲液代替培养基。储存条件:避光，冷冻保存细胞染色专题之七:曙红Y曙红】EosinY中文名「水溶伊红;四渙荧光黄:朝红;四漠荧光素钠;曙红钠盐;曙红,水溶性:黄光曙红英文名：EosineYellowisli,Biomoeosine,TetiabromofluoiesceinC.I.name:Acidled87分子式C20H6O5Bi4Na2分子量:691.9性质「以AgN03滴定B「,I-,SCN-等时用作吸附指示剂。CASNiunber:17372-87-1MDLnumbei:MFCD00005040ColouiIndexNumber:45380光谱性质最大吸收524.8nm;最大激发490mu染色原理：EosinY为酸性染料，将胞质染成粉红色（嗜酸性，是组织和细胞化学常用染色试剂之一，常与苏木精（hematoxylm,为碱性染料，将核染成紫蓝色（嗜碱性联合使用（HE染色法。在免疫组织化学实验中,常作为衬染试剂以便于组织和细胞结构的观察。存储条件「室温避光保存细胞染色专题之八:苏木精苏木精Hematoxylin中文名:苏木色精，苏木色素，苏木精、苏木素，洋苏木素英文名:Hematoxyli7,11b-Diliydiobenzmdeno[1,2-d]pyian-3,4,6a,9,10（6H-pentol,NatiHalBlack分子式C16H14O6分子量：302.28性质:无色棱形晶体谴光变红;熔点100-120°C滩溶于冷水和乙瞇易溶于热水和热乙醇，溶于碱、氨和硼砂的溶液。含有3分子结晶水，在100〜120°C溶于本身的结晶水中。在水溶液中，特别是在碱溶液中易被空气氧化成红棕色的氧化苏木精。C.I.name:NatuialblackC.I.nunibei:75290CASnumber:517-28-2EINECSliumbe匸208-237-3BeilsteinRegistiyNumber:91400EG/ECNumbe匸2082373MDLnumbei:MFCD00078111染色原理：苏木精是染细胞核的优良材料，他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。分化时组织所染的颜色因处理的情况而异，用酸性溶液（如盐酸一酒精分化后呈红色,水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水分化后呈蓝色、水洗后呈蓝黑色。用途:—种天然媒介染料。用于蚕丝、毛皮和皮革的染色以及棉布的印花，用不同的媒染剂可得到蓝色或黑色。与重辂盐、铁盐、亚铁盐、铝盐和锡盐等一起可制成各种色淀。在分析化学中用于比色分析、显微镜分析,并用作pH值指示剂，变色范围5.0〜6.0,由黄色变紫色。作为天然色素、多用于食品工业、日化工业、皮革及织物染色等,病理实验中可作为细胞组织切片的染色剂•苏木水提物最早被发现有抗癌作用，随后的研究证明了其抗癌活性物质就是苏木精细胞染色专题之九:孔雀绿孔雀绿(MalachiteGreen中文名「孔雀绿，孔雀石绿,碱性绿，盐基品绿英文名【MalachHegreen,anilmegreen,basicgreen4,diamondgreenB,victoriagieenB,4-[(4-dinietliylaminoplienyl-plienyl-methyl]-N,N-duiiethyl-aiiiline分子式:C23H25C1N2(cliloiide分子量364.911g/mol(clilonde性质:孔雀绿是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀菌剂，可致癌。孔雀石绿一般有二种。第一种是天然的矿石，为水合碱式碳酸铜[Cu(OH2CO3或2CUOCO2H2O],呈翠绿或草绿色的块石，含71.9%CuO、19.9%CO2.比重3.9-4.03.能溶于酸类。主要用于铜的提炼和供作颜料，但并不用于水产养殖业。第二种是孔雀石绿染料(MalacluteGreenDyesniff,又有AnilineGreen、CliuiaGreen.VictoriaGreen等多个名称,是人工合成的有机化合物。它的生产是由1分子(mol的苯甲醛Benzaldehyde和2分子的二甲苯胺Dimethylaniline在浓盐酸混和下，加热缩合成隐色素碱Leucobase,在酸性下加过氧化铅使其氧化，并在(酸。碱。性液中沉淀出色素碱.它是属于三苯基甲烷型的绿色染料TryplienylMethaneDyestuffso绿色闪光结晶，溶于水、酒精显蓝绿色;遇硫酸呈黄色，稀释后呈暗橙色;水溶液加氢氧化钠形成微带绿光的白色沉淀。PH值在0.13-2.0变色为黄〜浅蓝〜绿,PH值在11.5〜13.2变色为蓝绿〜无色。CASnumber:569-64-2光谱性质:最大吸收616.5mn染色原理：孔雀石绿可用作生物染色剂，把细胞或细胞组织染成蓝绿色，方便在显微镜下研究。孔雀石绿也用作丝绸、皮革和纸张的染料。虽然称作孔雀石绿,但其实它不含有孔雀石的成份，只是两者颜色相似而已。用于芽鞄染色的步骤：取一干净载片按无菌法取巨大芽砲杆菌菌体少许制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加法7.6%的孔雀绿饱和水溶液，染色10分钟后、用水冲洗，再用0.5%蕃红花红液染色彩1分钟，水洗，风干后镜检。芽砲被染成绿色，营养体呈红色。细胞染色专题之十QAPIDAPI中文名46-联眯-2-苯基U弓際(?^XrS-4',6-dianudmo-2-plienylindole,2-(4-amidinopheiiyl-lH-mdole-6-caiboxamiduie,DAPIdilivdiochloiide分子式:C16H15N5分子量277.324CASnumber:28718-90-3光谱性质与双链DNA结合时最大吸收/最大发射为358nm/461nm;与RNA结合时，最大发射移动到400mn左右。DAPI为一种荧光染料,可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比,对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高（几乎为100%,旦对活细胞无毒副作用。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。a、 正常的烟草细胞核:核形完整,染色质均匀。b、 染色质固缩，向外周聚集，形成周边化。c、 染色质进一步固缩,形成很多颗粒物质。d、 细胞核破裂形成碎片，核解体。染色步骤：在细胞移植前，将DAPI以一定的浓度加入培养基中，与细胞共同孵育过夜，用PBS缓冲液漂洗至少6次以洗掉未结合的DAPI,在用酶消化后离心收集细胞，加入DMEM培养基制成细胞悬液以备用。存储条件上20°C避光保存（?4。（2?注意事项：1、 DAPI强烈致癌,操作时要戴上手套。2、 贮存液用70%酒精配制，浓度100pg/ml,可用黑纸包住，长期冻存。使用液按1:1000用PBS稀释，最终浓度100ng/mlo3、 DAPI是非常优秀的DNA染料，固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。细胞染色专题之十一:结晶紫结晶紫（ciystalviolet中文名「（结晶紫，氯化甲基玫瑰苯胺，结晶紫、龙胆紫，甲基青莲,碱性紫，甲紫，其溶液俗称“紫药水”英文名:ciystalviolet,Methylviolet2B,Methylviolet,methyliosamlineclilofide,GentianViolet,BasicVi