核酸的分离提取及定量课件

动物组织中核酸的提取动物组织中核酸的提取实验目的及意义能够说出组织DNA分离提纯的原理及方法并能够抽提制备DNA能够说出组织RNA分离提纯的原理及方法并能够抽提制备RNA。实验目的及意义2前言

核酸（nucleicacid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。

前言核酸（nucleicacid）是遗传信3分离纯化核酸的原则应保证核酸一级结构的完整性完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求减少化学因素对核酸的降解：温度不要过高；控制pH值范围(pH值5-9);保持一定离子强度;减少物理因素对核酸的降解：

避免机械剪切力破坏核酸结构分离纯化核酸的原则应保证核酸一级结构的完整性4分离纯化核酸的原则防止核酸的生物降解：细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。分离纯化核酸的原则防止核酸的生物降解：5分离纯化核酸的原则排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染无其他核酸分子的污染（如抽提DNA分子时应去除RNA分子）。分离纯化核酸的原则6核酸的性质DNA、RNA的理化性质特点：核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸具有两性性质，是两性电解质。由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸通常表现为酸性，等电点比较低。如DNA的等电点为pI4-4.5，RNA的等电点为pI2-2.5。DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体。DNA和RNA都是极性化合物，因此他们一般都微溶于水，而不溶于乙醇，乙醚，氯仿等有机溶剂。核酸的性质DNA、RNA的理化性质特点：7核酸的性质核酸的存在方式：

DNA和RNA在细胞中通常以与蛋白质结合的状态存在。他们与蛋白质结合形成的复合物分别称为DNP（脱氧核糖核蛋白）和RNP（核糖核蛋白）。

核酸的性质核酸的存在方式：8核酸纯化原理DNA分离纯化原理：

脱氧核糖核蛋白（DNP）在0.14mol/LNaCl中溶解度很低，而核糖核蛋白（RNP）却较易溶解，因此用上述浓度的NaCl洗涤组织匀浆，可得到DNP，再用氯仿-异戊醇除蛋白即可得到DNA。

RNA分离纯化原理：组织匀浆在酚与十二烷基硫酸钠(SDS)存在下，RNA与蛋白质分离。酚使蛋白质变性凝固，RNA则溶解在水相中，用乙醇使RNA从水相中沉淀而达到分离。核酸纯化原理DNA分离纯化原理：9DNA分离纯化实验步骤剪碎组织放入匀浆器加入0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA液7mL弃上清。沉淀中加入0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA液6mL混匀。匀浆，离心5000r/min，5min沉淀中加入3mL0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA,转入匀浆器匀浆，在搅拌下缓缓滴入250g/LSDS0.4mL匀浆，使沉淀悬浮均匀再加入2mol/LNaCl4mL（此时由于大分子脱氧核糖核蛋白的溶出，溶液粘度骤然升高，再匀浆，使之均匀）加氯仿-异丙醇5mL，剧烈振摇10min。混合物离心上层水液，下层氯仿，交界面为变性蛋白。收集上层水液边摇变加入等体积95%乙醇，即可见有长纤维状DNA析出5000r/min离心5min3000r/min离心10minDNA分离纯化实验步骤剪碎组织放入匀浆器加入0.14mo10RNA分离纯化实验步骤加入3mL0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液,250g/LSDS0.5mL，匀浆移入三角烧瓶中，65℃水浴中继续振摇5-8min，取出流水冷却5000r/min离心10-15min上层为稍浑浊含有RNA的水相，中层为变性蛋白质，下层为酚液，管底残渣含有DNA。收集上层水液于量筒中，测水液的体积，加入1/10体积的2mol/L醋酸钠溶液，混匀。再加2.倍体积预冷的无水乙醇，混匀，冷处放置至絮状沉淀充分形成（絮状沉淀即为RNA）再加入等体积80%酚（约4mL），匀浆RNA分离纯化实验步骤加入3mL0.05mol/L醋11核酸分离纯化中各试剂的作用

DNP在2mol/LNaCl中易溶解DNP在0.14mol/LNaCl中不溶RNP在0.14mol/LNaCl中易溶解

EDTA：DNA酶抑制剂

DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂EDTA，可抑制DNA酶活性。

氯仿异戊醇抽提：

氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层；异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。DNA分离纯化核酸分离纯化中各试剂的作用DNP在2mol/LNaCl12

乙醇沉淀法：

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

可用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。核酸分离纯化中各试剂的作用乙醇沉淀法：核酸分离纯化中各试剂的作用13RNA分离纯化：0.5mol/L醋酸-醋酸钠溶液使混合物中DNA沉淀

2mol/L醋酸醋酸钠溶液提供一定盐离子促进RNA沉淀SDS：阴离于型表面活性剂使蛋白质变性，有破胞和抑制核酸酶的作用；苯酚抽提法：苯酚是极强烈的蛋白质变性剂，它几乎使所有遇到的蛋白质都变性。能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。乙醇沉淀法：原理同DNA沉淀。核酸分离纯化中各试剂的作用RNA分离纯化：核酸分离纯化中各试剂的作用14尽量保持低温下操作，作时注意避免破坏核酸结构一般来讲，核酸沉淀应在低温下长时间下进行。但是低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。因此一般使用0℃冰水，10-15min，DN