黄芪对糖尿病肾病大鼠肾损害的保护作用

黄芪对糖尿病肾病大鼠肾损害的保护作用

随着糖尿病发病率的增加，各种检查和ct扫描逐渐增多，造影剂（cm）引起的急性肾损伤越来越多。造影剂肾脏黄酮症是糖尿病患者肾衰竭的重要原因之一。一项研究显示糖尿病氮质血症期进行心导管检查,CMN发生率高达50%,尽管多数患者肾功能短期内可以恢复,但常常增加住院天数,加重患者负担,少数甚至死亡,因而预防和治疗这种并发症具有重要意义。近年来,研究证实内皮素(ET)系统可能在CMN发生中起重要作用,有效抑制造影时ET系统的过高表达,具有一定的肾脏保护作用。但目前ET拮抗剂在临床上还未得到广泛运用,有研究证实黄芪可降低血浆及肾脏局部ET-1水平,具有抑制ET系统表达的作用,推测可用于预防CMN发生。为此,我们建立了单侧肾切除糖尿病肾病模型,对此进行探讨。材料和方法1尿糖的检测雄性Wistar系大鼠(体重180～200g,温州医学院动物房提供)30只,其中24只接受右侧肾切除(背部正中切口),2周后腹腔单剂量注射链脲佐菌素(STZ,Sigma公司)60mg/kg(溶解在10mmol/L枸橼酸缓冲液中,pH5.5),48～72h后尾静脉采血,用血糖仪(OneTouchⅡ型,强生有限公司)测定全血血糖,血糖≥16.7mmol/L,同时尿糖+++～++++以上确定为糖尿病大鼠,给普通饲料,自由摄水,饲养8周,随机分组。其他6只作为正常对照组。2糖尿病模型建立前煤为5d模型(1)正常对照组(C组,n=6);(2)糖尿病对照组(DM组,n=6):糖尿病模型建立8周时,禁水24h,1次性尾静脉注入等量生理盐水;(3)糖尿病+造影剂组(DM+CM组,n=6):糖尿病模型建立8周时,等量生理盐水灌胃,禁水24h,1次性尾静脉注入76%泛影葡胺(10mg/kg);(4)糖尿病+黄芪+造影剂组(DM+HQ+CM组,n=6):糖尿病模型建立8周时,黄芪(2g/250g)灌胃,禁水24h,1次性尾静脉注入76%泛影葡胺(10mg/kg)。3肾组织中et-1及etr-b的表达分别在CM注射后12～36h,用代谢笼收集尿标本,然后用3%水合氯醛腹腔注射,麻醉各组大鼠,行右侧颈总动脉插管,留取血浆,-70℃保存,待测肌酐和ET-1。肾脏经生理盐水充分灌洗,用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,制成4μm厚切片,做免疫组织化学。血、尿肌酐由日立7150型全自动生化分析仪测得;血浆ET-1用放射免疫法测定(试剂盒由北京美迪科学技术有限公司提供)。免疫组化:SP法检测ET-1、ETR-A及ETR-B在肾组织中的表达。石蜡切片常规脱蜡到水,加入3%H2O2-甲醇溶液室温下10min消除内源性过氧化物酶活性,用蒸馏水冲洗3次后加入抗原修复液(购自上海金浩公司),然后置于微波炉中煮沸10min后自然冷却,再用0.1MPBS溶液(pH7.4)漂洗3次,加入正常山羊血清室温下封闭15min,倾去玻片上的血清,分别滴加兔抗大鼠ET-1(1∶500,购自北京中山试剂有限公司),绵羊抗大鼠ETR-A(1∶200,购自上海普飞生物技术有限公司)、ETR-B(1∶200,购自上海普飞生物技术有限公司),室温下过夜。次日用PBS液漂洗3次,分别滴加生物素标记的羊抗兔IgG、驴抗绵羊IgG置于40℃烤箱中15min,弃去二抗后用PBS液漂洗3次,加入辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液室温下15min,用PBS液漂洗3次后于室温下滴加DAB显色液,镜下控制显色时间。充分显色后水洗终止显色,再用Hariss苏木素复染、1%盐酸酒精分化。酒精梯度脱水、二甲苯透明后以中性树胶封片。同时采用正常兔血清和删除第一抗体的方法作为阴性对照。显色结果在高倍镜(×400)下根据染色面积和强度进行半定量分析:-,无阳性染色;+,轻度阳性;++,中度阳性;+++,重度阳性。4统计方法数据用(x¯±s)(x¯±s)表示,组内差异比较采用t检验,组间差异比较采用方差分析。结果1糖尿病大鼠对小鼠血清泛影葡胺,血胱被控制监测总剂量,导致血肌病单侧肾切除糖尿病大鼠,喂养8周时,血肌酐较正常大鼠明显升高,血浆ET-1浓度、肌酐清除率明显降低,有统计学意义(P<0.05)。糖尿病大鼠黄芪灌胃,禁水24h后注射76%泛影葡胺,血肌酐有所升高,内生肌酐清除率有所下降,与糖尿病对照组无明显差异,与生理盐水灌胃组有显著性差异(P<0.05);血浆ET-1浓度较糖尿病对照组和生理盐水灌胃组有所升高,但无统计学意义。见表1。2肾组织病理学检测在光镜下观察,糖尿病大鼠与正常大鼠相比,肾小球大致正常,肾脏间质有程度不同单核细胞浸润。注射CM后,无论生理盐水灌胃组,还是黄芪灌胃,病理变化与糖尿病组相比均不显著。3dm和dm+cm对etr-a、etr-b、etr-b表达的影响免疫组化结果显示ET-1、ETR-A、ETR-B蛋白表达主要分布在肾小管间质,DM对照组ET-1、ETR-A、ETR-B比正常对照组表达显著增加,DM+CM组表达增加更显著,而DM+CM+HQ组表达较DM+CM组要弱。见表2。糖尿病cmn的免疫组化糖尿病CMN的发生机理目前还不清楚。有研究提示一些内源性缩血管物质,如儿茶酚胺、血栓素、血清素及血管紧张素Ⅱ等可能参与CM的缩血管反应,但尚有争议。近年来有学者研究认为内皮素-1(ET-1)在介导CM的缩血管反应方面起着独特的作用,但也有学者发现糖尿病患者发生CMN时血ET-1浓度并不升高,认为ET系统在糖尿病CMN发生过程中并不起重要作用。本研究显示糖尿病肾功能损害大鼠注射高渗CM,可引起急性肾损害,但注射以后血浆内皮素虽然有轻度升高,但与糖尿病对照组相比无明显差异,而肾组织内,特别肾间质ET-1及ET-1受体ETR-A和ETR-B表达明显增加,提示糖尿病CMN的发生可能与血液循环中ET浓度无关,而与肾脏局部的内皮素系统高表达,活性增加有关。血浆ET-1的病理生理作用一直存在争议。在大鼠和犬类实验中,静脉内注射几种不同的CM,循环中ET-1水平明显增加,应用ETR-A选择性拮抗剂或ETR非选择性拮抗剂阻断ETR可防止CM诱导的急性肾血管收缩,推测可能与CM直接刺激内皮细胞释放ET-1有关,是引起CMN的重要原因。最近,有研究认为血循环中的ET-1水平并不能反映组织局部浓度,也不足以引起直接的缩血管效应,ET-1主要通过自分泌、旁分泌形式起作用。我们的实验结果显示在糖尿病模型建成8周时血浆内皮素较正常大鼠内皮素低,注射CM以后,虽然有一定升高,但与糖尿病对照组相比,并无统计学意义,也提示在糖尿病CMN的发生过程中,血浆内皮素可能不起重要作用。肾脏内ET-1主要由内皮细胞、上皮细胞及系膜细胞产生和分泌,其作用由受体介导。ET-1受体有两型,即ETR-A和ETR-B。ETR-A主要位于血管平滑肌细胞上,介导ET-1缩血管反应,ETR-B主要位于内皮细胞上,可诱导NO及PGI2释放,介导ET-1扩血管反应。免疫组化方法可定位反映蛋白质的表达,便于推测蛋白质的功能。本文希望通过免疫组化了解肾脏ET系统表达情况。研究发现注射CM以后肾脏,特别是肾间质ET-1、ETR-A和ETR-B表达明显增加,有引起肾间质血管收缩,导致肾小管病变,促使肾损害的发生。提示肾间质局部ET系统可能在CMN的发生过程中起重要作用。目前对于CMN尚无有效的预防方法。曾有人观察到中药黄芪可降低实验性心衰模型、慢性肾衰竭患者血、尿ET-1水平,具有保护肾脏功能的作用。为此,本文建立了糖尿病CMN模型,对此进行研究。研究证实中药黄芪能减轻CM引起的肌酐升高和肌酐清除率的下降,可在一定程度上预防糖尿病