香菇多糖的提取及生物活性的研究

香菇多糖的提取及生物活性的研究

蘑菇又名蘑菇，属于担子菌、伞菌、侧耳科和蘑菇科。香菇中含有多种具有生物活性的药用组分,其中香菇多糖是目前已知最强的免疫增强剂之一。据资料显示,粗多糖进行脱蛋白提纯后生物活性更高。为了提高其活性,试验对脱色效果较好的质量分数为1%的活性炭脱色后的香菇粗多糖液中的蛋白质的去除方法进行了初步探讨。1试验材料和方法1.1氯甲烷ar材料:苯酚AR,硫酸AR,3,5-二硝基水杨酸AR,无水乙醇AR,三氯甲烷AR,正丁醇AR,三氯乙酸AR,酒石酸钾钠AR,蛋白酶酶活力(60万U/g)。设备:722S分光光度计,赛多利斯电子天平,抽滤瓶,布氏漏斗,分液漏斗,真空泵,旋转蒸发仪,超级恒温水浴,摇床,冰箱。1.2测量还原糖:3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法;总糖:苯酚-硫酸法;蛋白质含量测定:福林-酚法,以牛血清蛋白作标准曲线。1.3脱蛋白质法1.3.1正交试验设计在单因素试验基础上酶用量、温度、时间、pH值4因素,各取3个水平,以蛋白质含量为指标,选用正交表L9(34)进行试验,正交试验因素与水平见表1。1.3.2分层联合应用溶剂和分液器在一定体积的粗多糖溶液中,加一定体积的Sevag试剂(氯仿与正丁醇按照一定的比例混合)。充分混匀后静置一定时间,于分液漏斗中分层后弃去下层有机溶剂层及中间的蛋白质层。针对样液与Sevag试剂的体积比、氯仿与正丁醇的体积比、静置时间、振摇时间4个因素,设计4因素3水平的正交试验,各因素水平见表2。1.3.3因素水平的设计选定样品液与三氯乙酸-正丁醇的体积比、三氯乙酸与正丁醇的体积比、静置时间、振荡时间4个因素,各选3个水平,以蛋白质含量和多糖损失率为指标,做L9(34)正交试验,因素水平设计见表3。1.3.4酶法与sevag法相结合使用最优方案酶法和Sevag法相结合脱蛋白,重复5次。1.3.5酶法与三氯乙酸-正丁醇法的结合使用最优方案酶法和三氯乙酸-正丁醇法结合脱蛋白,重复5次。2结果与分析2.1为0.10%,a为0.10试验采用综合加权评分法,权重系数均为0.5,分别把2项中最大的指标定为100分,其他各号按下式评分:从F值和临界值比较看出,即使取α=0.10,各因素都无显著影响,相对来说A的影响大些,用(*)表示。由表4、表5可以看出,酶法脱蛋白的影响因素大小顺序为A>B>D>C,其中A因素各水平间有显著性差异,故确定最佳脱色条件为A2B2C1D3,即用酶量1%,酶解温度50℃,调节pH4.0,脱蛋白2h。2.2最佳脱蛋白条件的确定试验采用综合加权评分法,权重系数均为0.5,分别把2项中最大的指标定为100分,其他各号按下式评分:由表6、表7可以看出,综合蛋白质含量和多糖损失率2方面的因素来考虑,Sevag法脱蛋白的影响因素大小顺序为A>B>C>D,其中A因素各水平间有显著性差异,故确定最佳脱蛋白条件为A1B3C1D1,即选取样液与Sevag试剂的体积比为3:1,氯仿与正丁醇的体积比为6:1,振摇时间1min,静置时间15min为最佳组合,此组合正交表中没有,以此组合做验证试验得知此时蛋白质含量为6.18%,多糖损失率3.00%,为最佳组合。2.3脱色条件的确定试验采用综合加权评分法,权重系数均为0.5,分别把两项中最大的指标定为100分,其他各号按下式评分:综合评分=(蛋白质含量/8.59)×100×0.5+(多糖损失率/7.43)×100×0.5由表8、表9可以看出,综合蛋白质含量和多糖损失率2方面的因素来考虑,三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白的影响因素大小顺序为B>A>C>D,其中B因素各水平间有显著性差异,故确定最佳脱色条件为A1B1C3D3,即选取样品液与三氯乙酸-正丁醇的体积比为1:2,三氯乙酸与正丁醇的体积比为1:5,振摇时间30min,静置时间3h为最佳组合,此组合正交表中没有,以此组合做验证试验得知此时蛋白质含量4.33%,多糖损失率2.09%,为最佳组合。2.4脱蛋白次数对蛋白质去除率和多糖损失率的影响使用最优方案酶法和Sevag法相结合脱蛋白,重复5次;使用最优方案酶法和三氯乙酸-正丁醇法结合脱蛋白,重复5次。结果如图1、图2。从图1和图2可以看出,酶法和三氯乙酸-正丁醇法蛋白质去除率高,多糖损失率相对酶法和Sevag法要少,当脱蛋白次数增加时,蛋白质含量都呈减少趋势,但多糖损失率呈增加趋势,酶法和三氯乙酸-正丁醇法结合脱蛋白,脱蛋白次数4次时,蛋白含量1.97%,多糖损失率4.58%;5次时蛋白含量1.93%,多糖损失率6.79%;酶法和Sevag法相结合脱蛋白4次时蛋白含量2.91%,多糖损失率6.73%,5次时蛋白含量2.88%,多糖损失率7.13%,脱蛋白次数达到5次时,酶法和三氯乙酸-正丁醇法蛋白含量降低不多,多糖损失率却呈急剧上升趋势。3香菇多糖脱蛋白方法试验结果表明,当脱蛋白次数增加时,蛋白质含量都呈减少趋势,但多糖损失率呈增加趋势,综合考虑蛋白质去除率和多糖损失率,最后确定香菇多糖脱蛋白方法最优方案是酶法和三氯乙酸-