结核杆菌实时荧光定量pcr快速检测方法建立及应用

中国农学通报2010,26(10):1-ChineseAgriculturalScience结核杆菌实时荧光定量PCRCFP10S中图分类号S855.9+ 文献标志码 2009-Abstract:AccordingtothesequenceoftheMycobacteriumtuberculosisCFP10genetoestablishedaSYBRGreenIreal-timePCRmethodthatcoulddetectMycobacteriumtuberculosisCFP10gene.DesignedandsynthesizedapairofCFP10geneprimertobuildpositivestandardsamplethatcontainingthesequenceoftherecombinantplasmid.Testresultsshowedthatagoodlinearrelationshipofthismethod,correlationcoefficientofthismethodreachedto0.997,thelowestdetectionthresholdofthismethodwas1×101copies/μLthathigher100timesthantheconventionalPCRmethod.ThemethodhashighsensitivityandstrongspecificandgoodrepeatabilitythatcanbeusedtodetectthepathogenofMycobacteriumtuberculosisandquantitativebcuosT）[10CFP10因组RD1区操纵子编码的低分子量蛋白[2，只存在于CFP10作为抗原可以将结核病与结核分支杆菌感染

结核病疫情至关重要。荧光定量PCR（fluorescentquantitativePCR，FQ-PCR）增的同时实现模板的定量测定。荧光定量PCR包括荧光探针和SYBRGreen两种方法，其中SYBRGreen对于易变异的病原具有更高的特异性和灵敏（2006DA33740院，E-ma：mr-0522@63com。com--·2 中国农学通报度[4。试验将构建个包含结核分支杆菌标准株H37Rv核酸5′端翻译区的重组阳性质粒，并运用LightCycler(LC)基于SYBRGreenⅠ进行FQ-PCR检测，为结核杆菌CFP10基因的荧光定量快速检测提供

程有限公司，SmartCyclerⅡ实时荧光定量PCR仪为美国Cepheid公司。GenBankCFP10全序（NC-000962），Primer3.0软件设计选择5′端保守区，扩增产物288bpddH2O溶解为μmol/L-模板DNA表1P(游引物2做常规CR10×fr2.5μ10oLNTP08μ2各0.2μ，aqNA0.5μNA2μLddHO添加至25μL。采用以下循环参数：94℃预变性5n95℃5060℃3072℃303072℃延伸7nR产物于%琼脂糖凝胶NA收产物-0℃储存备用。按P-T载体说明书将目的DH5α感受态细R鉴定。对R实时荧光定量PCR根据荧光曲线形态和PCR反应最快的原则来确测定质粒OD260nm和OD280nm值，OD260nm/OD280nm值在1.8~2.0的质粒方可用于制作标准曲后，将其10倍系列稀释成含有1×1021×1031×104、建立25L量R反应3步法在美国eped公司SarycerⅡ实时荧光定量R算机软件根据定量标准模板的扩增情况绘制标准曲线。实时荧光定量PCR将质粒标准品10倍系列稀释成含有1×10~1×109模板进行常规PCRreal-timePCR和常规PCR敏感性的差异。将提取的DNA，采用PCR方法扩增结核分支杆菌标准株H37Rv的CFP10基因，结果得到约288bp的目的片段。PCR产物回收后与PGM-T载体连接构建成重组质粒PGM-T-CFP10，然后将其转化到DH5α感受态细胞。选取阳性菌落进行PCR鉴定。进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定。证实成功构建（见图1）。用测定的重组质粒序列与GenBank中的结核分支杆菌标准株H37Rv的CFP10基因序列进行比较，结果氨基酸序列同源性达100%。实时荧光定量PCR析和电泳鉴定只有单产物、荧光信号强为标准，得M1200900700500M120090070050030000模板进行实时荧光定量PCR，得到检测CFP10的扩增曲线呈典型的S（PCR扩增曲线的标准。标准曲线见图34。y=-0.302x+10.642，斜率为-0.302，接近-0.30Ct值呈现良好的r2达到0.997增产物形成单Tm值为88，无引物聚体及特异性产物的出现。2.4实时荧光定量PCR图1最佳反应体系：20EvaGreen0.6μL，2PCRbufferforEvaGeen12.5μL，5μmol/L浓度的上下游引μLho板2.0μL。最终确定实时荧光定量PCR的反应条件：s95℃s60s72s4810倍系列稀释的质粒标准品（1×1021×1031×1041×101×1061×107copies/μL）图3实时荧光定量PCR

最低检出限为1×10copies/μL（如图PCR检出的最低限为1×103copies/μL（如图5）。表明实时荧光定量PCR比常规PCR的敏感度高100倍。图2实时荧光定量PCR图4SYBRGreenIreal-timePCR实时荧光定量PCR由图6可见，不同来源的结核杆菌的扩增结果呈典光定量PCR可用于来鉴别结核杆菌与其他常见杆菌 图5常规PCR梯度稀释图6实时荧光定量PCR·4 中国农学通报图7试验总共检测了60份临床样本，其中RT-PCR阳培养结果致，图7为部分样品的检测结果。内结核杆菌感染的日益严重[6。全球有2000万活300万人死于结核，中国每年有12.7万人死于结核病。结核病成为危害人类健康的重要传染病之。对结核分支杆菌的研究再度成为全球研究的热点。CFP10的编码基因Rv3874存在于结核分支杆菌RD1缺失的基因区域，RD1区仅存在于致病性分支杆菌包CFP10所具有的重要价值，因此可将CFP10作为诊断实时荧光定量R量等优点逐渐成为实验室和临床诊断中的主要方法。SYBRenⅠ是种双链DA双链DA1000荧光信号的增加与R产物的增加完全同步[8，在实时荧光定量R对核酸的检测和定量中广泛应用。其优势在于能监测任何双链NA试验根据CFP10基因序列设计特异性引物，经转化，构建了质粒标准品，并基于SYBRGreenⅠ荧

光染料的特点成功制作了检测CFP10基因的实时荧光定量PCR标准曲线，确定了最佳读板温度。结果表明，建立的实时荧光定量PCR的线性关系很好，直线回归方程的相关系数r2达到0.997；敏感性很高，检出下限达1×10copies/μL，比常规PCR敏感100倍；产物出现唯的特异性条带，CFP10SYBRGreenⅠreal-timePCR检测方法的成功建立，为快速检测病原[]WordHeathOrganzatonGobatubercuosscontro:surveance,pannng,fnances[R]WHOReport,2006ArendSM,GeukA,vanMejgaardenKE,etaAntgencequvaenceofhumanT-ceresponsestoMycobacterumtubercuoss-specfcRD-encodedprotenantgensESAT-6andcutureftrateproten0andtomxturesofsynthetcpeptdes[J]InfectImmun,2000,68(6):334-曹晓慧,张媛媛,PCR技术在结核病诊断中的应用[J]中国人兽共患病杂志,2005,2(2):0-2ChungWB,ChanWH,ChaungHC,etaRea-tmePCRforquanttatonofporcnereproductveandrespratorysyndromevrusandporcnecrcovrustypennaturay-nfectedandchaengedpgs[J]JournaofVroogcaMethods,2005,24(-2):-YangZZ,HabbM,ShuaJB,etaDetectonofPCVDNAbySYBRGreenI-basedquanttatvePCR[J]JZhejangUnvScB,2007,8(3):62-69[J]中国预防医学杂志,200,GordonSV,BroschR,BautA,etaIdentfcatonofvaraberegonsnthegenomesoftubercebacusngbacter