第二章常用生化分析技术

第一节光谱分析技术第二节电化学分析第三节电泳技术第四节层析技术第五节自动生化分析技术第二章

常用生物化学分析技术

光谱分析技术是根据物质吸收或发射辐射能而建立起来的一类分析方法，因不同分子的原子和原子团，其发射光谱和吸收光谱不同，而相同的物质在一定条件下，其发射光谱和吸收光谱的强度与该物质的含量成正比关系。因此可对物质进行定性和定量分析，此类技术称为光谱分析技术。光谱分析技术是一种最常用的生化检验技术，它主要包括：

吸收光谱分析：可见、紫外、红外分光光度法和原子吸收分光光度法

散射光谱分析：散射比浊法和透射比浊法

发射光谱分析：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法

光是一种高速传播的电磁波，光的波长（λ）的常用单位是纳米（nm），可见光波长400～760nm，＜400nm称为紫外光，＞760nm称为红外光，波长愈短，能量愈大。可见、紫外吸收光谱是由于多原子分子的价电子在电磁辐射的作用下，由基态跃迁到激发态，这种因物质分子对辐射能的选择性吸收而得到的光谱称为吸收光谱。第一节吸收光谱分析吸收光谱分析法包括可见、紫外、红外和原子吸收分析法。其中最常用的是可见光分析法，也被不严格地称为比色分析法，准确的名称应是可见光分光光度法。

用于比色分析的光源与被测溶液的颜色应为互补色。可见、紫外吸收光谱用于定量分析的依据是光吸收定律，即Lambert-Beer定律，它是吸收光谱法的基本定律。

一、Lambert-Beer定律

1.Lambert定律当一束强度为Io的单色光透过某种吸光溶液后，由于溶液吸收了一部分光，则透过的光线为It。当溶液浓度不变时，透过的液层愈厚，则光线强度的减弱愈显著。ItI0用数学式表示为：

透光度随溶液厚度增加而减少，其关系是透光度的负对数（－lgT，吸光度A）与溶液厚度成正比，即

2.Beer定律当一束强度为Io的单色光透过某种吸光溶液后，若液层厚度不变，而浓度不同时，溶液的浓度愈大，则透过光的强度愈弱，其定量关系A=K·C。

当液层厚度不变时，吸光度与溶液浓度成正比，这就是Beer定律。

3.Lambert-Beer定律合并Lambert定律与Beer定律可得

A=K·L·C

说明吸光物质对单色光吸收的强度与物质的浓度和液层厚度成正比。

吸光系数K的物理意义是吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度，在给定条件下（波长、溶液性质、浓度）吸光系数是物质的特征常数，K值愈大，能测定的浓度C愈小，则灵敏度愈高。

二、比色分析仪器

即可见光分光光度计，各类分光光度计的结构和原理基本相同，一般包括光源、单色器、吸收池、检测器和显色器五大部分。

1.光源可见光常用钨灯，现用卤钨灯；紫外光常用氢灯。

2.单色器可用滤光片、棱镜、光栅。

3.吸收池

(比色杯)

4.检测器光电管或光电倍增管

5.显示器指针式或数字式三、比色分析的特点

1.灵敏度高被测定物质的最低浓度一般为10－5～10－6mol/L。

2.测定快速、简便。

3.应用范围广一些无色物质在一定条件下与显色剂反应，可生成有色物质。四、比色分析的定量方法

（一）对比法

又称标准对比法，通常在测定未知浓度样品的同时，测定一已知浓度的标准液作比较，然后分别测定两者的吸光度。

AS=KLSCS

AR=KLRCR

因测定成分相同，故K值相同，比色时用同样规格的比色皿故LS=LR，所以比色分析中测定标准液与未知液吸光度的比值也就等于其浓度的比值，即若标准液与样品用量不等时，则再乘。用对比法进行定量时，为了减少误差，选用标准液浓度应尽可能接近待测样品浓度。

（二）标准曲线法

配制一系列浓度不同的标准液，按一定操作方法显色后，用选定的波长分别测定它们的吸光度，然后以吸光度为纵坐标，标准液浓度为横坐标，在坐标纸上标出各坐标点，通过连接各点，使其成一直线，即A-C曲线。·····A0.60.50.40.30.20.124681012C

注意事项

1.测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘制。

2.标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。

3.当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。

4.标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。

用波长200～400nm的紫外光谱测定无色物质的方法称为紫外分光光度法。芳香族类及含有共轭双键的烯烃、炔烃等不饱和烃类，在200～400nm波长范围具备光吸收特性，故不需经显色反应就能直接利用紫外分光光度法测定，其选择性和灵敏度均高于比色分析法。五、紫外分光光度法

（一）单组分测定原理其基本原理与可见分光光度法相同，除可采用前述的标准曲线法和对比法外，还可采用：

1.吸光系数法对于单一组分的纯物质，只要已知其摩尔吸光系数，测得吸光度（A）后，可直接按下列公式计算物质的浓度。

例：已知维生素B12的水溶液在361nm波长处的ε为28056，2ml维生素B12的水溶液用蒸馏水稀释到4ml，用1cm比色杯测得溶液的吸光度为0.414，求该维生素B12水溶液的浓度。（二）多组分混合物的测定原理多组分指同一试样中含两种或两种以上待测组分，测定时可根据各组分吸收光谱的重叠程度来确定定量方法。

1.各组分吸收峰不相互重叠按单组分测定方法

2.各组分吸收峰相互重叠

可采用解联立方程法，等收吸双波长法、系数光谱法。

（一）火焰光度法是利用火焰使金属元素激发，能发射出特征谱线的特点进行测定的一种方法。

1.基本原理

某些金属元素的基态原子受到火焰激发后，其外层电子获得能量而从基点跃迁到激发态，接着它们又以发射光谱的形式释放出所获得的能量，而返回基态，在相同条件下，同一元素所释放的单位能量相同，故能形成固定光谱。六、其它光谱分析技术

如钠发射光谱波长589nm，钾发射光谱波长767nm。由于火焰供给的能量不强，只能激发碱金属和碱土金属元素，生化检验中常用于钾、钠的测定。元素的发射谱线强度与该元素浓度的关系可表示为I=a·c·b

a是与试样组成，激发温度，激发电位有关的常数，b为自吸收系数，当浓度很低时，b≈1，所以上式可写成I=a·c，即发射谱线强度与测定元素浓度成正比。

2.干扰因素（1）共存元素的干扰

①共存元素产生的辐射干扰由于火焰使标本中其他元素激发，当发射时光谱接近，甚至重叠时，可产生干扰，引起误差，如钙对锂、钠的测定干扰明显。②阳离子的干扰主要是通过对待测阳离子的电离度产生影响，造成发射时强度的改变。③阴离子的干扰因阴离子可与某些被测阳离子在火焰温度下形成仅能缓慢蒸发的化合物而抑制了原子激发，一般用释放剂来消除干扰，与干扰阴离子牢固结合。（2）火焰对测定的影响火焰是激发光源，火焰的纯度和燃烧状态，稳定性，可直接影响分析结果的准确度，因此，要求所用燃料燃烧时火焰背景色浅，温度高，无杂色。（3）标准品的影响由于生物样品中成分复杂，定量测定中会互相干扰影响测定的准确性，所以，如果以单纯的被测物质预制标准液则与血清样品的结果相差甚远，故应使用血清作为标准以消除影响。（二）原子吸收分光光度法

1.基本原理待测元素经原子蒸气发生器转化成气态原子（处于基态），由空心阴极灯提供的待测元素的共振线经过待测元素的蒸气，共振辐射强度被蒸气中待测元素的基态原子吸收而减弱，其吸收规律遵循Beer定律。

共振线：电子从基态跃迁至第一电子激发态的最低振动能级所吸收的谱线为共振吸收线。简称为共振线。

2.应用在医学检验中主要用于体液、毛发、指甲等组织钙、镁、铁、钠、锌、铝、汞、铅、砷等多种元素的测定。优点：①选择性好受干扰少，原子吸收是光的窄带吸收，仅0.001～0.01nm，而分子对光的吸收是宽带吸收，达几个nm。②灵敏度高能测定10－9～10－6g的元素。③测定快速、简便④应用范围广只需更换不同空心阴极灯，仪器昂贵。

（三）荧光分析法利用某些物质光致发光的特性，籍此对物质进行定性，定量分析的方法。

1.基本原理

某些物质的分子吸收了光能，从基态跃迁至某一电子激发态中的某一振动能级，处于激发态的振动能级中的分子通过运动或与其他分子的碰撞而将吸收过多的能量输给其他分子，并返回到第一激发态的最低振动能级，同时发射荧光，跃迁到基态发射荧光，在一定浓度范围内，其荧光强度与溶液浓度呈线性关系。

2.影响荧光强度的因素（1）溶剂

增大溶剂的极性，可时电子跃迁的能量降低，荧光增强。（2）温度、pHT↑分子碰撞频率↑，因此荧光强度随温度升高而减弱。pH可影响化合物电离或使荧光物质水解，如苯胺在pH7～12溶液中主要以分子形式存在，产生蓝色荧光，而在pH<7或>13的溶液中以离子形式存在，不能产生荧光。（3）激发光和发射光在定量测定时，一般应选择荧光物质的最大激发波长（λex）和最大荧光波长（λem），但有些荧光物质化学性质不稳定，受激发光照射后易分解，缩短样品照射时间，改变激发光波长。（4）物质浓度的影响荧光分析品适合稀溶液，因荧光物质浓度高，分子间碰撞增加，使荧光强度减弱，这种现象称为自熄灭，自熄灭现象随浓度增加而增强。

3.仪器与测定方法作为荧光分析的仪器有光电荧光计和荧光分光光度计光电荧光计的结构与光电比色计很相似，不同之处是检测器与光线成直角，并多一块滤光片。如滤光片改为棱镜或光珊作单色器，就和可见紫外发光光度计相似而成荧光分光光度计。仪器的组成部件的比

光源单色器测定池 光敏元件检测器光电比色计钨灯滤光片玻璃光电池检流计

(二面透光)光电管 光电荧光计卤钨灯滤光片玻璃光电管检流计

(300～700nm)两块(四面透光)检流计可见紫外钨灯光栅或棱镜分光光度计(400～760nm)玻璃光电管检流计氢灯石英光电倍增管自动记录

(200～400nm)荧光分光氙弧灯光栅或棱镜玻璃光电倍增管自动记录光度计 (200～700nm)石英 氙弧灯发射的强烈紫外线对人眼有害。

荧光分析优点：①灵敏度高比可见紫外吸收光谱高103～104倍。

②特异性强通过选择合适的激发光波长和荧光波长可避开其它物质干扰。

③操作简便、快速、重现性好

④样品用量少不足之处：①应用范围有一定局限性，因许多物质不能产生荧光。②对测定条件要求严格，如试剂、溶剂不应含有荧光物质。③仪器价格较贵荧光分析法在医学检验中可用于测定类固醇激素（肾上腺皮质激素）及代谢产物，单胺类神经递质（儿茶酚胺，5-HT）某些维生素（VitA，B族）。

电化学分析是一种以溶液电化学性质为基础测定物质含量的分析方法。按测定量的电化学参数的不同，可分为电位法、电导法、库仑法、极谱法和伏安法等，下面主要介绍电位法中的离子选择电极法。第二节电化学分析是一种电化学敏感器，它的电势与溶液中给定离子的浓度的对数成线性关系，故可以通过简单的电位测量，直接测定溶液中离子活度。

离子浓度与离子活度的关系

a=f.c

在稀溶液中（10－4mol/L以下）活度系数接近1。离子选择电极（ionselectiveelectodeISE）

ISE分析法的优点：

1.是一种直接的非破坏性分析方法，可反复进行，不受样品溶液颜色、浑浊等因素的干扰。

2.分析速度快，单次分析通常只1～2min

3.测量范围宽，4～5个数量级

4.操作简便

5.测量特定离子活度，对临床医学和基础医学更有实用意义

ISE大都属于膜电极，膜中含有与待测离子相同的离子。膜的内表面与具有相同离子的固定浓度溶液接触，其中插入一内参比电极，当膜的外表面与待测离子溶液接触时，引起膜电位的改变。由于电极膜材料、制备方法不同，使电板的稳定性、选择性和灵敏度也不同。一、ISE分析法的基本原理一、ISE分析法的基本原理

膜电位的产生：将电极插入待测离子溶液中时，由于离子的交换和扩散作用，改变了两相中原有的电荷分布，因而存在一定的电位差，因为内充溶液中有关离子的浓度恒定，内参比电极的电位固定，所以ISE的电位（E）只随离子活度不同而改变，其电位可用Nernst方程式表示。

ISE的E值不能直接测定，必须将ISE与参比电极浸入被测溶液中组成原电池，然后通过电动势来测定E值。

参比电极：是指在温度、压力恒定的条件下，当被测溶液离子浓度有所改变时，电极电位保持不变的电极。离子选择电极晶体膜电极均相膜电极非均相膜电极刚性基质电极流动载体电极非晶体膜电极基本电极气敏电极敏化电极酶电极二、离子选择电极的分类（一）晶体膜电极

其敏感膜为金属微溶盐，经加压成片，制成单晶、多晶或混晶体电极敏感膜，如氟电极，其敏感膜为LaF3单晶片。（二）非晶体膜电极

1.刚性基质电极其敏感膜为玻璃，故称为玻璃电极。成分一般为Na2O-AI2O3-SiO2改变这三种成分的配合比例，分别制出对Li+、Na+、K+、Ag+的离子选择电极。

2.流动载体电极其敏感膜是由溶解在与水不相混溶的有机溶剂中的离子缔合剂或混合剂作为离子交换体，再将此溶液渗透在具有惰性，微孔性和疏水性的塑料薄膜内。（三）气敏电极

是基于界面化学反应对气体敏感的电极，它是在一般的离子选择电极的基础上，再覆盖一层疏水的透气膜（如聚四氟乙烯），如CO2、NH3电极。（四）酶电极

它由离子敏感膜和覆盖在表面含有酶的酶涂层胶组成，敏感膜对待测物的酶促反应有选择性响应，如尿素酶电极。

1.响应范围及检测下限：响应范围是指电极对待测离子的响应符合Nernst式的线性区，此范围越宽越好，一般在4～7个数量级之间，检测F限是指能够检测被检离子的最低浓度一般在10-5～10-7mol/L。

2.选择性

是指电极对待测离子和共存干扰离子的响应程度的差异。常用选择性系数或选择比系描述，选择性系数越小，表示电极选择性越强。三、离子选择电极的性能

3.响应斜率和转换系数

ISE在Nevnet响应范围内被测离子活度变化10倍所引起的电报电位变化的数值，即响应斜率（S）。从理论上说，但对某一ISE来说，实际S值与理论S值并不完全相符，其偏差用转换系数表示，一般转换系数达到理论值90％以上的电极性能较好。

4.电极寿命取决于电极制作材料，结构和使用保管情况。

1.标准曲线法配制一系列不同浓度标准溶液，测定其电位值Es，绘制Es-lgc标准曲线，在相同条件下测定样品溶液电位值Ex。

2.电极校正法用标准溶液校正ISE，制成直读式电仪表。四、IES的分析定量方法

1.电动势测量，对于一价离子的响应，电势测量每差1mV引起浓度的相对误差为4％，对于二价离子则为8％，因此对于测量电势的仪器精度要求达到0.1mV。

2.温度

Nernst公试中的斜率，内参比电极的电信号，以及离子活度等都与温度有关，因此在整个测量过程中应保持温度恒定。五、ISE分析方法的误差

3.pH

溶液pH值可影响被测离子在溶液中的存在形式，从而影响相应离子的活度，如LaF3电极测定F－时，如pH＜5，F－则会生成HF，使结果偏低。

4.滞后效应

使用ISE若先测浓溶液后，再测稀溶液时电位平衡缓慢并出现误差，这一现象称为“滞后效应”。一、电泳的基本原理（一）

电泳的概念溶液中带电颗粒在直流电场中向电荷相反方向移动的现象称为电泳。利用电泳现象对物质进行分离的技术叫电泳技术。第三节

电泳技术电泳技术的应用始于1937年，瑞典Tiselius利用界面电泳将血清蛋白质分离成五种成分。

1948年Wieland发明纸电泳，使电泳技术大为简化。此后，电泳技术发展迅速，特别是电泳技术与层析法，免疫学方法的结合，使其分辨率达到mg/ml水平，成为医学检验的一种重要分析技术。（二）

溶液中粒子的带电状态蛋白质分子电离时有带正电荷的氨基，也有电离带负电荷的羧基，故蛋白质是一种两性电解质。在酸性条件下，羧基电离受抑制，－NH2→-NH3+

带正电在碱性条件下，羧基电离增强，－COOH→－COO－带负电。

（三）

电泳迁移率

指带电粒子在单位电场强度作用下的电泳速度，通常用μ表示

μ=V/EV为粒子移动速度（cm/s）E为电场强度（V/cm）迁移率取决于带电粒子的性质（粒子所带电量Q，粒子大小r形状）介质粘度η，对于球状分子，根据Stoke定律

V=QE/6πrηU=Q/6πrη在实际测定中，电泳速度V以单位时间t（秒）内移动的距离d（厘米）表示

V=d/t（cm/s）电场强度E以单位长度I（厘米）上所施加的电势差V（伏特）表示

E=V/I（V/cm）故u=V/E=（d/t）/（V/I）

=d×I/V×t（cm2/v.s）通过测量d,l,v,t便可计算出颗粒的迁移率。由于不同的带电粒子其迁移率的不同，因此在同一电场中的移动距离不同，故能将其分离，根据公式

dA=V.t/l×μAdB=V.t/l×μBA、B移动距离差为

Δd=(dA—dB)=（dA—dB）×V.t/l

分离距离与电压和电泳时间成正比，与支持物长度成正比。二、电泳的分类和电泳仪（一）电泳的分类1.根据被分离样品的多少分析电泳，制备电泳。2.根据电泳电压的高低常压电泳，高压电泳。3.根据是否使用支持介质自由电泳，区带电泳。4.根据电泳系统的组成是否均一连续电泳，不连续电泳。

（二）电泳仪

由直流电源和电泳槽两部分组成。1、直流电源将交流电源经整流，滤波后获得。分为

（1）恒压电源电泳过程中的电压恒定不变。但电泳过程中的热效应，降低外周电路的电阻，使电流慢慢增大。（2）恒流电泳电泳过程中的电流恒定不变。用这种电流的输出电压可随外周阻力减少而减少，从而保持电流恒定。（3）恒功率电源电泳中输出功率恒定不变。主要用于等电聚焦电泳。2.电泳槽盛装缓冲液和进行电泳分析的场所，一般用塑料和有机玻璃制成，它包括电极，缓冲液槽，电泳支架，透明盖组成。电泳槽的外形有水平式，垂直式，圆盘式等多种。电极应具有良好的导电性，抗腐蚀性和抗电解作用。以铂金材料最为理想，最好贯穿整个缓冲液槽。三、影响电泳的因素（一）缓冲液维持电泳介质pH恒定，并起导电作用。1.组成由弱酸和弱酸盐组成，常用的有磷酸盐，硼酸盐，巴比妥盐和三羟甲基氨基甲烷（Tris）等，其中巴比妥缓冲液用的最多，由巴比妥钠和巴比妥组成。选择缓冲液时应考虑的因素：（1）化学性能稳定，不易水解。（2）缓冲液的pH应与弱酸的pK值接近，有较强缓冲能力。（3）缓冲液中正负离子应有相近的迁移率，避免电晕出现正负离子分布不均。（4）缓冲液的离子应该是一价的，多价离子有较厚的双电层，移动性差。（5）缓冲液的电导率要低，避免通电时产生较多的热。2.pH

缓冲液pH决定了蛋白质的带电状态，电泳时应选择一个合适pH，使各种蛋白质在这一pH时净电荷差别最大以利于分离。血清蛋白醋酸纤维薄膜电晕常用pH8.6的巴比妥缓冲液。各种蛋白质均带负电荷，电泳时向正极移动。缓冲液pH的计算pH=pKa+lg([盐]/[酸])电泳过程水会发生电离。正极：2OH－→H2O＋1/2O2↑＋2epH↓负极：2H＋＋2e→H2↑pH↑故电泳2～4次后应将缓冲液正极交换，减少这种影响。3.离子强度是指溶液中各种离子的摩尔浓度（Ci）与其电荷数平方（Zi2）乘积总和的1/2。即

I=1/2∑CiZi2I的单位是mol/L。如0.1mol/LNaCLI=0.1mol/L0.2mol/LMgCL2I=0.6mol/L

对于缓冲液I计算，由于弱酸的电离度很低，一般只计算盐的。

I愈大，缓冲能力越大，pH越稳定，但缓冲液所载分电流增加，样品所栽的电流减少，电泳速度减慢，导电能力增加，产热增加。

I过小，缓冲能力小，pH不稳定，缓冲液所载分电流减少，样品所载分电流增加，缓冲液粘度系数降低，电泳速度加快。但样品在支持物上扩散严重，分辨率降低。兼顾两方面的影响，一般在0.05~0.1mol/L。

（二）支持介质对支持介质的基本要求是具有化学惰性，不与被分离的样品或缓冲液起化学反应，并具有一定的坚韧度。

1.吸附使被分离样品滞留，而降低电泳速度，造成拖尾而使分辨率降低。

2.电渗电泳过程中液体对固体支持物的相对移动称为电渗。实际上是电泳材料表面的电荷引起水的定向移动。当电渗作用方向与电泳方向一致，电泳速度加快，顺水行舟。当电渗作用方向与电泳方向相反，电泳速度减慢，逆水行舟。四、常用电泳技术区带电泳是目前应用最广泛的一种电泳技术，区带电泳的支持介质常用的有滤纸，醋酸纤维薄膜，凝胶等。（一）滤纸电泳（PE）是应用最早的支持介质。优点：材料价廉易得，有一定机械强度。缺点：电泳时间长，8～10h，吸附作用大，造成拖尾而降低了分辨率，目前已淘汰。

（二）醋酸纤维薄膜电泳（CAE）

1957年Kohn首先采用，醋酸纤维素是将纤维素分子中葡萄糖单体上的羟基乙酰化而形成纤维素醋酸酯，然后用丙酮和水的混合溶剂溶解，涂成均匀薄膜。优点：对蛋白质吸附作用很小，分辨率高，区带清晰，不吸附燃料，区带周围燃料可完全清掉，检测灵敏度较高，样品用量少0.3~2μl，电泳时间短20min~1小时，可透明，便于用光密度扫描仪定量。缺点：有轻度电渗作用，吸水性较差，较脆。

（三）琼脂糖凝胶电泳（AGE）琼脂糖是从琼脂中分离得到的一种多糖。主要由半乳糖和L-3，6-脱水半乳糖构成。常用浓度0.5~1.0%。优点：吸附作用，电渗作用很小，故分辨率重现性好，应用广，同工酶，脂蛋白，免疫电泳，样品用量少0.6~3.0μl，电泳时间短30min~1h。透明度好，电泳后可直接扫描定量，也可烘干制成薄膜。缺点：电泳完毕后区带易扩散，可及时固定。点样方法，挖孔法，滤纸插入法。

（四）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是一种人工合成的高分子材料，60年代新用于电泳分析，能将血清蛋白分为20多种组成。优点：

1.具有分子筛作用，分离效果好。

2.化学稳定性高，是一种稳定的亲水胶体。

3.几乎没有吸附和电渗作用。

4.机械强度好，无色透明，可直接光密度扫描。

5.可调节凝胶孔径以适合不同分子量的分离。

1.聚合丙烯酰胺＋甲叉丙烯酰胺聚丙烯酰胺（Acr）单体（Bis）交联剂化学摧化过硫酸铵-TEMED（四甲基乙二胺）系统加速剂TEMED促使引发剂过硫酸铵形成自由基，自由基与Acr接能，使Acr单体形成自由基而活化，从而引发聚合，聚合速度与pH，单体浓度，温度有关。催化系统引发剂加速剂光催化核黄素-TEMED系统，核黄素经光照被还原成无色核黄素，在和痕量氧的条件下，无色核黄素又被氧化成核黄素自由基，使Acr活化，从而引发聚合。优点：核黄素用量少（10mg/L），对样品分析无影响，聚合时间可通过调节光照时间，强度来控制。

2.孔径与机械强度凝胶孔径由凝胶总浓度和交联度决定。凝胶总浓度T（g/dl）表示100ml凝胶中Acr和Bis的总克数，T值越大，孔径越小。

交联度C（%）表示交联剂Bis占凝胶总浓度T的百分比，C值越大，孔径越小。

T值固定不变时，C值在5%时，凝胶孔径最小，大于或小于5%，孔径都会增大。

常用标准胶T=7.5g/dl，孔径约5nm。凝胶的机械强度、弹性、透明度全要取决于T及Acr与Bis的比值。通常要求：

T为2%~5%Acr/Bis=205%~10%Acr/Bis=4015%~20%Acr/Bis=125~2003.分类圆柱型根据凝胶的形状水平式平板型垂直式根据凝胶系统和缓冲液组成：连续（均相），操作方便。不连续（多相），分离效果好。

4.分离原理聚丙烯酰胺凝胶电泳大多属于不连续电泳。

（1）两种不同孔径的凝胶系统

（2）电泳过程中形成不均匀不连续系统

上层大孔径浓缩胶T2~3g/dl、Tris-HCl、pH6.7。下层小孔径分离胶，T5~10g/dl，Tris-HCl，pH8.9。电极缓冲液Tris-甘氨酸pH8.3。

（3）电极槽两层凝胶中的缓冲液pH和组成不同。高分辨率主要是由于下面三种效应

1.样品浓缩效应

Cl－迁移率最大，快离子，解离度最小的甘氨酸离子迁移率最小，慢离子。蛋白质离子介于两者之间，快离子与慢离子之间形成低导电区，有较高的电位梯度，促进蛋白质和慢离子的移动，使蛋白质样品被压缩为一薄层。

2.分子筛效应蛋白质进入分离胶，由于凝胶有一定的孔径，不同的蛋白质分子大小不同，受到的阻力不同，小分子受阻力小，走在前面，大分子受阻力大，走在后面。

3.电荷效应同一般电荷。五、蛋白质区带的定性和定量分析

（一）蛋白质区带的染色蛋白质电泳分离后可以直接用紫外光密度扫描仪定量（利用蛋白质对280nm紫外光的吸收），但需专门的仪器，故临床上一般采用染色来进行定性或定量分析。蛋白质染色剂大多是阴离子燃料，易与蛋白质阳离子结合，因此在pH＜pI的酸性溶液中较强。常用的染色剂有氨基黑10B，溴酚蓝，丽春红S。（二）蛋白质区带的定性分析经染色后，首先应仔细观察有无异常区带。如多发性骨髓瘤病人有大量单克隆蛋白质（主要是IgG或IgA）电泳时可在β和γ之间呈现一条区带，称为M区带。（三）蛋白质区带的定量分析

蛋白质电泳的定量分析通常以各区带占总量的百分率表示如同时测定了蛋白质总量，也可换算成各组分的绝对量（g/L）表示。总蛋白75g/LA:66%α1:3%α2:7%β:10%γ:15%49.5g/L2.25g/L5.25g/L7.25g/L11.25g/L1.光密度仪直接扫描法透明的电泳图谱可用光密度仪直接扫描得出各组分的百分率。操作简便，迅速，误差小，结果较准确。2.洗脱比色法染色后将各区带分别剪下侵入适当的溶剂中，将蛋白质吸附的染料全部洗脱然后进行比色，求出各组分的百分含量。操作繁琐，费时，准确度不如光密度仪直接扫描法。六、特殊电泳技术（一）等电聚焦电泳（IFE）是利用具有线性pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点不同的蛋白质等两性分子的一种电泳新技术。其分辨率可达0.01pH单位，特别适用于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质分子。正常人血清蛋白质采用此法可分出50多条区带。1.基本原理在电泳系统中建立一个从正极到负极，pH由低到高的连续而稳定的pH梯度。处于这一系统的各种蛋白质，根据各自pI与所处环境pH值的差别带上正电或负电，电泳时逐渐靠近与其pI相同的pH位点，而不断失去净电荷，直至达到pH=pI，净电荷为零时，不再受电场力的作用，而达到聚焦。

2.基本条件①建立一个稳定、重复性良好的连续pH梯度。②有一个抗对流的材料，防止已分离样品重新混合。③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带。3.pH梯度的建立能建立稳定pH梯度的两性电解质是一种多羧基、多氨基的脂肪族化合物。如瑞典LKB公司生产的商品名为“Ampholine”的，它由丙烯酸和多乙烯多胺合成。理想的两性电解质载体应具备以下特点：（1）各成分的导电能力彼此相近。

（2）各成分的pI彼此接近，并在pI附近有良好的缓冲能力。

（3）分子量小，易于与样品分离。

（4）对280nm紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品测定。（二）

双向电泳

是先把样品从一个方向进行电泳分离，然后在与其成90。方向上进行第二次电泳分离。如第一次电泳可以其电荷性质为基础；第二次电泳则以分离量不同进行分离。通常将等电聚焦电泳为第一相电泳，以SDS-聚丙烯酰胺凝胶为第二相电泳。

（三）

转移电泳又称印迹转移电泳。此项技术是1975年由Southern在进行DNA片段的研究中首先使用。将凝胶电泳所得区带经吸附作用转移到硝酸纤维薄膜（NC膜）上，由于转移过程类似于将墨迹吸到吸水纸上，故称为(Southernbolt印迹法)。

1977年Alwine将此法应用于RNA研究，取名Nerthernblot。

1979年Towbin又将其扩展到蛋白质研究，将其风趣的称为Westernblot.1981年，Reinhart等将等电聚焦电泳后的蛋白质转移到NC上，取名为Easternblot.

转移电泳技术包括三个步骤

1.采用凝胶电泳分离蛋白质或核酸，电泳方式有单向，双相，梯度，等电聚焦等。

2.转移电泳，将已分离的蛋白质或核酸经电泳转移到NC或重氮苄氨基甲基纸上，前者为非共价吸附，后者为共价结合。

3.鉴定膜上的蛋白质或核酸，方法有，放射自显影，酶标免疫化学等。

转移电泳的优点:对分离蛋白质的鉴定，比在凝胶上的操作要简便，转移电泳实际上是将凝胶电泳的高分辨率与放射标记或酶标等免疫化学法的高灵敏度结合起来。第四节层析技术

层析法又称色谱法、色层分离法，1906年由俄国植物学Jauett首先用于植物色素的分离提取而得名。目前，层析技术发展迅速已成为生物化学、分子生物等及生物工程等学科常用的分离分析方法，如气体、无机离子、AA、糖类、脂类、Vit、药物，以及大分子物质、蛋白质、核酸等物质的分析。一、层析的概念与分类（一）基本概念

层析法是利用待分离物质中不同组分的某些理化性质（在两相中溶解、吸附、紊和作用等）的差异而建立起来的一种分离技术。所有的层析系统均由因定相和流动相组成，固定相是固体物质或固定于固体物质的液体，流动相是可以流动的物质。如水、某些溶剂和气体。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于混合物中各组分的理化性质的差异，它们在固定相和流动相中的分配比不同，随溶媒的向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配，与固定相作用力越弱的组分，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动速度快，反