4种伪狂犬疫苗多重pcr扩增的研究

4种伪狂犬疫苗多重pcr扩增的研究

伪病毒素（pm）也被称为嗜毒症，是由嗜毒症科和嗜毒症科（ad）引起的一种或几种动物感染的急性传染病。猪是唯一的自然宿主,是病毒的长期贮存和排出者,在伪狂犬病的传播上起着重要的作用。该病毒可引起怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎;新生仔猪衰竭死亡,死亡率可达100%;成年猪多呈隐性感染,长期带毒排毒,成为该病的主要传染源,可进行水平传播和垂直传播。国外一些专家认为,PR给养猪业造成的经济损失仅次于猪瘟和口蹄疫。世界动物卫生组织(WorldOrganizationforAnimalHealth,OIE)将其列为法定报告动物疾病的B类多种动物共患病,我国也将其列为二类传染病。PR在我国流行范围很广,迄今为止已有20多个省份发生过该病。自20世纪70年代以来,人工筛选的自然弱毒疫苗及基因工程缺失疫苗的广泛应用,对防制伪狂犬病做出重要贡献。随着PCR技术的建立和广泛应用,国内外许多学者开始逐渐将其应用于PRV的检测[9,10,11,12,13,14]。我国使用的Bartha-k61株弱毒疫苗,其基因中有包括整个gE和大部分gI序列的缺失。美国研制出的世界上第一个伪狂犬病病毒基因工程缺失疫苗(OMNIVAC-PRV),在1986年获得美国政府颁发的生产许可证,这一疫苗其中也缺失了gE基因。20世纪90年代以后,欧美等国家规定只允许含gE基因缺失的疫苗生产上市。目前,不少国家又研制出了不同的基因缺失疫苗,它们都具有不同的表型,但大多数缺失苗都表现在gE和TK基因的缺失上,这是因为gE和TK基因都是PRV的主要毒力因子,作用在于能降低PRV对猪神经系统入侵能力,并且gE基因是PRV复制所非必需的。gB是病毒的一个重要包膜组分和中和抗原,是所有糖蛋白中最保守的,对于病毒的感染必不可少,而gB基因对PRV的复制也是不可缺少的。鉴于此,笔者根据最保守存在的gB及缺失的gE或TK基因序列,设计了3对引物,建立了检测猪伪狂犬疫苗毒和野毒的三重PCR方法。该方法可以应用于PR疫苗毒和野毒的准确、快速诊断和流行病学调查,同时对于预防、治疗及消灭PR也有重要作用。1材料和方法1.1猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒属5种猪伪狂犬病毒(PRV),2型猪圆环病毒(PCV2),猪细小病毒(PPV),猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)均由农业部畜禽病毒学重点开放实验室分离保存。1.2na聚合酶、dntp、dnamarUNIQ-10柱式病毒DNA抽提试剂盒购自上海生工;TaqDNA聚合酶(5U/μl)、dNTP(25mmol/L)、2×GCBuffer、DL2000DNAMarker均购自Takara公司;DNA片段快速胶回收试剂盒购自北京博大泰克。1.3方法1.3.1dna的提取商品化的冻干疫苗用研磨杵研为粉末,置于1.5mlEppedorf管中,后加入200μl的TEBuffer(pH8.0)溶解,随后按照DNA抽提试剂盒说明书进行。PRV细胞毒及商品化的液体乳化苗则直接按说明书进行操作。制备的DNA模板于-20℃保存备用。1.3.2引用属性根据GenBank中PRV的gB、gE、TK基因序列设计3对引物PB1、PB2;PE1、PE2;PT1、PT2。序列如表1所示。1.3.3优化pcr扩增条件对PCR的引物浓度、dNTP的浓度及PCR的扩增条件进行优化,筛选出PCR扩增最佳反应模式。1.3.4桑尼公司测序将PCR产物用DNA片段快速胶回收试剂盒回收,送往上海桑尼公司测序。利用基因分析软件DNAStar分析测序结果,将所测定基因序列与已公布的PRV基因序列比较。1.3.5特异性试验用上述检测方法对PCV2、PPV的DNA和PRRSV、CSFV的cDNA进行检测,以验证该检测方法的特异性。1.3.6pcr检测dna按上述方法提取DNA,用紫外分光光度计测量DNA含量为1375μg/μl,并将DNA从10-1~10-10稀释作为模板,进行PCR扩增。1.3.7子牙菌的检测将市售的四种商品化疫苗作为被检材料,进行PCR检测。2结果与分析2.1pcr方法的构建和产物序列分析2.1.1pcr引物、tk引物、taq酶活性通过对PCR反应条件与试剂的优化,确定下列反应方案:20μl反应体系中加入2×GCBuffer10μl,dNTP2μl,gB引物各0.4μl,gE引物各0.3μl,TK引物各0.35μl,Taq酶0.5μl,模板2μl,H2O3.4μl。反应条件为95℃预变性5min,95℃变性50s,61℃退火1min,72℃延伸45s,35个循环,72℃延伸10min。2.1.2r产物大小扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳观察,发现PCR产物大小分别为427、298和208bp(图1),与预计条带大小相符。测序结果与GenBank公布序列比较,同源性在96%以上。2.2pcr检测的特异性该检测方法中未发现PCV2、PPV、PRRSV、CSFV的片段,说明该方法具有很强的特异性(图2)。2.3板片中dna的检测将DNA从10-1~10-10稀释作为模板时,都成功地扩增出了目的条带,但亮度随着稀释倍数的增加而递减,并且最低检出DNA含量为137.5fg/μl(图3)。2.4pcr对商品性疫苗的检测PCR检测4种商品化PRV疫苗的结果表明,除1号疫苗属于gE、TK基因双缺失疫苗外,其余都为gE缺失疫苗(如图4)。3多重pcr检测目前用于PR抗原或抗体的检测方法,主要有病毒分离、血清中和试验、酶联免疫吸附试验、荧光抗体试验及分子生物学诊断技术等。而常规的血清学等检测方法,无法区分PRV疫苗免疫猪和野毒感染猪。PCR方法是一种分子生物学诊断技术,可以应用于许多情况,例如:实验室不能持续提供细胞;样品中没有感染性病毒存在;诊断及区分不同毒株等。基于以上原因,笔者根据PCR原理,建立了一种多重PCR检测技术。该检测方法利用设计引物扩增片段长度的不同,仅用一步反应,既能检测PRV感染,又能有效鉴别疫苗毒和野毒,结果判定简便、直观、敏感性高、特异性强、稳定性好,极大地提高了PRV的检出率,是检测PRV较为理想的一种手段,有广阔的应用前景。PCR扩增的特异性与引物设计有很大关系。为了避免产生非特异性反应,笔者设计的3对引物GC含量相似,Tm值相近,保证了3个基因能够在相同的退火温度下得到良好的扩增。另外,由于伪狂犬病毒GC含量