蘑菇毒素的研究与应用

蘑菇毒素的研究与应用

蘑菇毒素的研究始于20世纪60年代，是对著名有毒鸡膏的研究开始的。到了20世纪50年代已经分离、纯化、鉴定出鹅膏毒肽(amatoxins)、鬼笔毒肽(phallotoxins)和毒伞素(virotoxins)等,因而有人获得了1927年和1964年的诺贝尔化学、生理学奖,引起世人瞩目。研究表明,蘑菇毒素具有特殊的生物活性,如对癌细胞的杀伤力等,人们期望能够通过对它的毒性成分、药理学研究寻找到一种理想的药物,使之成为治病良药,这是当前摆在菌物学和药物学工作者面前的一项重要研究课题。有关毒蘑菇方面已有许多出色的论述。本文对主要蘑菇的毒性成分、中毒机理以及应用前景进行了概述。1主要毒蘑菇及其毒性成分和中毒机制1.1毒蝇充碱melo-4-5毒蝇鹅膏又称毒蝇伞、捕蝇菌、蟾斑红毒伞、蛤蟆菌。分布于吉林、辽宁、黑龙江和四川等省。该菌属神经毒类,食后异常兴奋并产生幻觉,古代欧洲人把它用做参战士兵的兴奋剂和药酒,或用于狂欢节上。最初的成分报告见于1869年,但真正分离提纯出毒蝇碱(muscarine)是到了1954年由瑞士人C.H.Eugster完成的。当时他利用1250kg蘑菇子实体得出纯毒蝇碱3～4g(含量0.0003%),并鉴定出许多异构体(见图1)。其中,L-(+)-(2S,3R′,5S)-毒蝇碱(muscarine)的毒性最大,通过对小白鼠的毒理实验得知LD50为0.23mg/kg。另外,毒蝇鹅膏中还含有异鹅膏胺(muscimol)、鹅膏氨酸(ibotenicacid)和异鹅膏氨酸(muscazone)等。1958年日本北海道大学松本氏等曾选择性地进行人工合成毒蝇碱,并利用离体青蛙心跳运动的增减实验得到证明。在黄色(var.formosa)和白色(var.alba)变种中isoxazole类毒性成分基本没有变化,为0.17%～0.18%,但夏季采样含量较高,有人指出长时间的干燥保存会导致毒性丧失。毒蝇碱可溶于水,毒性极强。由于它刺激副交感神经,引起心跳减慢减弱,加强腺体分泌,增强胃肠蠕动,发生平滑肌痉挛,瞳孔缩小,对中枢神经也有异常兴奋作用。因此,食后常表现为兴奋、产生幻觉、流汗、流涎、流泪,肺部水肿而呼吸困难,昏迷甚至死亡。Muscarine除了在Amanitamuscaria和A.pantherina中有分布外,在鹅膏科以外的类群中也有报道,如在丝膜菌科的丝盖伞属(Inocybe),口蘑科的离褶伞属(Lyophyllum)、杯伞属(Clitocybe)、小菇属(Mycena)中均有一定的含量。例如有人报道在丛生离褶伞(Lyophyllumconnatum)中含0.012%,Clitocybegibba中含0.01%～0.18%,C.illudens中含0.0075%,C.rirulosa中含0.035%。1.2药物和体外制剂毒鹅膏也叫毒伞、绿帽菌、蒜叶菌、鬼笔鹅膏。分布于吉林、黑龙江、江苏、安徽、福建、广东、广西。据报道,在欧洲毒蘑菇中毒事件中有90%～95%是由于误食此菌而造成的,仅1个子实体就足以使人致死。本世纪30年代开始,Th.Wieland等人对它的环肽毒性成分进行了分析研究,根据其结构和性质可分为鹅膏毒肽(amatoxins)、鬼笔毒肽(phallotoxins)2种,其中前者为一类双环八肽,毒性比后者强10～20倍。有趣的是该属另一可食种Amanitarubescens中也含有phallotoxins,动物实验证明:鹅膏毒肽为毒鹅膏的主要毒性物质,小白鼠LD50为0.2～0.5mg/kg。目前已被纯化分离鉴定的天然产物有α-鹅膏毒肽(α-amanitin)、β-鹅膏毒肽(β-amanitin)、γ-鹅膏毒肽(γ-amanitin)、ε-鹅膏毒肽(ε-amanitin)、三羟鹅膏毒肽酰胺(amaninamide)、一羟鹅膏毒素酰胺(amanullin)、一羟鹅膏毒肽羧酸(amanullinicacid)、羧基鹅膏毒肽酰胺原(proamanullin)和三羟基鹅膏毒肽(amanin)等9种(见图2),属于慢性毒素,一般中毒后9～12d死亡。近年来,用人工合成的方法得到了40种以上的衍生物,并了解到S==OS=Ο的有无和环肽的结构及其整个空间结构的变化均可影响其毒性。张志光等(1998,私人通讯)利用分布于我国湖南的灰花纹鹅膏(Amanitafuliginea)为材料,分析结果为主要毒性成分α-amanitin(6788.3μg/g)和β-amanitin(2633.8μg/g)的含量均比欧洲的毒鹅膏所含α-amanitin(1757μg/g)和β-amanitin(1607μg/g)高出1～3倍。鬼笔毒肽是一类双环七肽,天然产物有二羟鬼笔毒肽(phalloidin)、一羟鬼笔毒肽(phalloin)、一羟鬼笔毒肽原(prophalloin)、三羟鬼笔毒肽(phallisin)、羧基三羟鬼笔毒肽(phallacin)、羧基二羟鬼笔毒肽(phallacidin)、羧基一羟鬼笔毒肽(phallisacin)等7种,属于速效毒素。LD50为1.5～4.0mg/kg。amatoxins和phallotoxins在子实体的不同部位中的含量也不同。关于amatoxins和phallotoxins的毒性机理,目前已有定论。Fiume等多年研究发现amanitin中毒的小白鼠肝细胞核仁碎裂,并且细胞核中的RNA含量持续减少。进一步的研究证明,体内或体外由amanitin处理的鼠肝细胞核的RNA合成被严重阻断,因此认为amanitin具有抑制RNA聚合酶的活性,从而阻碍了蛋白质的合成。给实验动物少量phallotoxins后可立即引起肝脏肥大,造成明显的机能性障碍。Phallotoxins与细胞中的肌丝蛋白(F-actin)进行专一性的相结合,极大地稳定了F-actin的结构,促使了肌球蛋白(G-actin)的聚合,从而打破了F-action与G-actin的动态平衡状态。张志光等用amatoxins和pahllotoxins的粗毒液处理绿豆种子,强烈抑制其下胚轴生长和蛋白质合成。该菌属于肝损伤型。食后潜伏期较长,一般为6～12h,初期症状为恶心、呕吐、腹痛、腹泻,随后呼吸困难、面肌抽搐、肌肉痉挛,肝、肾细胞严重损坏,肝肥大或萎缩,昏迷致死。在本属另一种剧毒蘑菇白毒伞A.virosa中,Th.Wieland(1980)分离得到称为毒伞素(virotoxins)的一群化合物,共6种(图3)。其结构与phllotoxins相近,毒性机理也类似。据报道,鹅膏科以外的种类如盔孢菌Galerinafasciculata、秋盔孢菌G.autummnalis、褐鳞环柄菇Lepiotahelveola等中也含有上述毒性成分。1.3月夜菌LampteromycesjaponicusKawam.Sing.月夜菌又名毒侧耳、日本侧耳、日本亮耳菌。分布于我国东北和日本。外形、颜色上接近香菇(Lentinulaedodes)而易被人误食。中毒属胃肠型。有人从中分离出分子量为264的3种毒性成分illudineS,isoilludineS和dihydrolludineS,并用X线衍射法鉴定出其空间结构。其中,成分(1)具有较强的抗癌活性,可医治小白鼠的Ehrlich腹水癌。但是,它的毒性也很厉害,如在12h内投0.6mg的量即可使小鼠致死。LD50为50mg/kg。由于毒性过强而目前尚未制成药物。成分(2)和(3)是成分(1)的衍生物,成分(2)既没有毒性也没有抗癌活性,成分(3)虽没有抗癌活性,但被认为是和菌体发光有关的物质。后来又发现了illudinM成分,并于1968年对这类物质进行研究,毒性机理不详,人工合成如下。1.4鬼伞素的毒性成分墨汁鬼伞俗名柳树钻、鸡腿蘑。在欧美被称做Inkycap的鬼伞是一类特殊的蘑菇类群。单独食用并不引起中毒,但在食用时或在食用后的2～3d之内饮酒即可引起脸部红肿,心率上升,头晕、恶心、呕吐,并出现呼吸困难等现象。症状同酒精中毒时服用的四乙基硫代尿咪disulfiram(antabuse)一样,其毒性成分鬼伞素(coprine)首先由美国人Hatfield等(1936)分离得出,收率是160mg/kg。进一步的试验证明,鬼伞素的体内水解产物1-aminocyclopropanal为主要毒性物质,它对雄性实验动物的生殖细胞带来直接的影响,可减少精原细胞和精巢的重量。鬼伞素的结构式为:从毒性机理上讲,虽然鬼伞中从未分离出disulfiram,但对它的作用现有所了解,主要是由乙醛氧化为醋酸盐时阻碍乙醛脱氢酶的作用,从而增加了血液中的乙醛浓度所引起的。除了墨汁鬼伞外,同属的其它种类如晶粒鬼伞(C.micaceus)、毛头鬼伞(C.comatus)和口蘑科的油口蘑(Tricholomaflavovirens)、棒柄杯伞(Clitocybeclavipes),球盖菇科的翘鳞伞(Pholiotasquarrosa),牛肝菌科的褐黄牛肝菌(Boletusluridus)等也是“有条件的食用菌”,易引起disulfiram式中毒。1.5致幻药物的成分为广泛分布于各地的一种腐生菌。误食后引起神经精神型中毒症状,如醉酒一般,手舞足蹈,行动不稳,狂笑或产生幻觉,重者死亡。古代墨西哥土族人在宗教仪式上常食用当地的一些小型伞菌而达到“神仙”般的梦幻感觉。经Wasson夫妇和Heim、Singer等真菌学家们实地考察发现他们所用的是球盖菇属(Stropharia)、光盖菇属(Psilocybe)和锥盖伞属(Conocybe)的20多种小型蘑菇。后来瑞士的Hofman等人(1958)的分析结果得知,这些蘑菇中含有与LSD(Lysergicaciddiethylamide,一种致幻剂,非菌类产物)相似的成分光盖伞素-二甲-4-羟色胺(psilocybin)及其水解产物光盖伞辛-二甲-4-羟色胺(psilocin),含量分别为0.2%～0.46%和0.005%(依产地、季节而有所变化)。据研究报告,在裸伞中也含有上述2种物质。人服用4～8mg的psilocybin(相当于干子实体2g)即可产生幻觉,如服用量增至5～15mg时就伴随痛感乃至发生中毒症状。有人认为桔黄裸伞的毒性与它的苦味成分有关,并分析、鉴定出其苦味成分gymnopilinA和B:最近,Kusano,G等从桔黄裸伞中分离得出另一种毒性(致幻)成分cerevisterol。食用致幻蘑菇所出现的症状较为复杂,产生异常的错觉、幻觉、妄想等等。因为实验动物很难再现这些感觉,所以对它的作用机理与应用方面的研究较为滞后。目前一般认为,毒性物质与LSD类似作用于中枢神经至脊髓,从而导致交感神经和生理机能的变化。在阿根廷光盖伞(Psilocybeargentipes)、P.subcaerulipes、P.coprophila、P.fasciata、P.merdaria、碟形斑褶菇(Panaeoluspapilionaceus)、P.subbalteatus、P.semiovatus、安地拉斑褶菇(P.antillarum)、紧缩斑褶菇(P.sphinctrinum)、条缘裸伞(Gymnopilusliquiritiae)、绿褐裸伞(Gymnopilusaeruginosus)、黄盖小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)、Agrocybefarinacea等蘑菇的子实体或菌丝中也测到致幻物质psillocybin。1.6鹿花菌素的毒性此菌因地区差异也有食用者,一般认为用开水泡可拔毒。但在欧洲中毒死亡率为14.5%～34.5%,仅荷兰自1953～1962年的10年间,在138名中毒患者中竟然有100人经治疗后仍死去。是否Gyromitra的所有种都含有毒素gyromitorin与此相接近的类群,如马鞍菌属(Helvella)、钟菌属(Verpa)、羊肚菌属(Morchella)、盘菌属(Peziza)等生食或熟食均有中毒报告。鹿花菌的毒素是由Boochm和Kueiz(1885)开始研究的,当时被命名为马鞍菌酸(Helvelicacid)。后来Fries等进行了结构鉴定,发现口服它的提取物有中毒症状,而水合物则无毒性。1967年化学结构式终于被确定,并命名为鹿花菌素(gyromitorin),研究指出鹿花菌素的水解产物甲基联胺(mnomethylhydrazine,MMH)为主要毒性物质:MMH对粘膜的刺激性大,通过皮肤也能吸收。狗、猴等动物腹腔内给予后24h内其30%即可通过尿排出体外。对小白鼠的肝、胃、肠、膀胱有损害作用,LD50为1.24mg/kg。含毒素0.0078%的水溶物给白鼠饮用后即能引起肝、肺、胆囊的癌变。报告指出,食用前如煮沸10min可去掉99.5%的毒性。有关MMH的作用机理,认为是对γ-aminobutyricacid(GABA)的代谢阻碍所造成的。主要是MMH对合成GABA相关的GlutamicAcidDecarboxylase(GAD)和GABATransaminase(GABA-T)有抑制作用,从而制止GABA的产生。除了鹿花菌以外,马鞍菌(Helvellaelastica),疣孢褐盘菌(Pezizabadia)中也含有相同的毒素。1.7日本法上的秋生铬病毒属别名焦脚菌、秋生鳞耳。为子实体较小的剧毒菌,形态上与蜜环菌(Armillariamellea)和光帽鳞伞(Pholiotanameko)的幼小子实体相近而易引起中毒。1957年至1974年间在日本有17例中毒病人,其中3人死亡。美国也有中毒报告,只是种类有所不同,是同属的Galerinafasciculata或G.venenata引起的。目前已证明,它们中也含有鹅膏毒肽,尽管在量上有别,秋生盔孢菌含amanitin为1.5mg/g(干),边缘盔孢菌(G.marginata)为1.45mg/g。由于该属真菌含有与鹅膏属相同的毒性成分,因此其毒性症状和机理也与鹅膏类相同。一般经过14～20h的潜伏期后开始头晕、头痛、呕吐、腹泻、血压下降、昏迷甚至死亡。2民间鉴别土办法鉴定难关于毒蘑菇的鉴别从古至今有着各种各样的探索,民间鉴别的土办法就不少于几十种。但是,真正依据所含的化学成分进行鉴定的却寥寥无几。现将文献报道的少数毒蘑菇的化学鉴定法介绍如下。2.1亚侧耳和生物测定月夜菌与亚侧耳(Panellusserotinus)形态相似,但用BaSO4液(3mL纯水加8mL浓硫酸,再加1gBa(OH)2溶解即可,10d内有效)可容易鉴别,菌肉上滴1～2mL溶液后无颜色反应者为毒菌月夜菌,而呈红紫色的是美味食用菌亚侧耳。有人利用月夜菌中所含的acidphosphatase(ACP)酶活性高,carboxyesterase(CE)酶活性低且能够特异性地染色的原理,使用电泳法与含有同样酶的、形态特征上容易混淆的香菇和侧耳(Pleurotusostreatus)相区别。2.2薄层层析分离法毒性成分amanitins的鉴别曾使用Meixnertest法。此种方法比较简便,将新鲜蘑菇的汁液或抽出液滴在新闻纸上,并使之吸收、干燥,然后再滴1滴浓盐酸,据呈色反应而决定。根据粕谷、山下等人对鹅膏属和其它毒蘑菇的测定,结果不十分明显,有中间类型和交叉现象。以浓缩的蘑菇汁液作材料,用氯仿ue5fe乙醚ue5fe醋酸ue5fe水为75ue5fe33ue5fe7.5ue5fe5作展开剂进行薄层层析,然后用1%的cinnamicaldehyde乙醚喷雾,在盐酸蒸气上显色。在7种鹅膏与α-amanitin标准品进行薄层层析,只有白鹅膏和毒鹅膏的Rf值接近标准样的0.19。总之,毒性成分的鉴别方法尚未成熟,还没有一种简便、通用的方法。目前毒蘑菇的鉴别主要是靠形态鉴别。应该指出的是,有的蘑菇本身并没有毒,但食用不适当可引起不良反应。如尖顶羊肚菌(Morchellaconica)、硫磺菌(Laetiporussulphureus)、黄汁乳菇(Lactariuschrysorheus)、黑菇(Russulanigricans)、蜜环菌、褐疣柄牛肝菌(Leccinumscabrum)等蘑菇生食容易中毒。而有的是因为食用量过多而引起中毒,如金黄枝瑚菌(Ramariaaurea)、毒蝇口蘑(Tricholomamuscarium)、毛钉菇(Gomphusfloccosus)等等。有人报道,香菇因超量食用引起肠梗阻。另外,有些蘑菇(如滑子蘑、香菇等)的孢粉对一些人有过敏现象。从严格意义上讲,这些均不属于毒蘑菇的范畴。3蘑菇及其毒性成分的开发3.1鹿花菌类物质据文献报道,有些毒菌在一定条件下是可食用的,如毒蝇鹅膏干燥半年以后加热食用或用水、盐水浸泡,剥掉盖皮就可以安全食用;豹斑鹅膏干燥后也可以食用,而在古代西伯利亚地区曾经做参战士兵的兴奋剂,或泡酒饮用,或用其盖皮卷烟抽;鹿花菌的毒性成分MMH的沸点为83.5℃,因此,食用前煮沸片刻即可拔毒;胶鼓菌(Bulgariainquinans)的卟啉(pophyrins)类物质经草木灰或碱水浸泡后即可除掉。除了直接食用外,蘑菇体内所含的一些可食用成分,如鹅膏菌含增味成分或香气成分;毒蝇口蘑的增味成分的鲜度比味精(谷氨酸钠)高20倍。3.2-amni有效治疗小鼠细胞的增殖蘑菇毒素的药用研究是目前一项热门课题。如上所述,鹅膏属的很多种类所产生的毒素amnitins对生活细胞具有强烈的破坏作用。由此人们就推想用它或用其衍生物去选择性地杀死癌细胞,这是一种极具诱惑力的想象,实际上这项工作目前已有了一定的进展。Grna用α-amanitin医治了氨基偶氮甲苯(aminoazotoluene)诱发的小鼠皮肤肿瘤,β-amanitin也有类似的应用之例。然而,由于毒素成分的收率低,资源有限,又不能人工合成,所以此类产品在国际市场上价格十分昂贵(10万美元/g)。amanitins也有抑制病毒复制的作用,粗提物也可做农药、杀虫剂。光盖菇属菌所含的幻觉类物质(gymnopilinA,B)对神经病的