荧光显微镜直接计数法在海洋细菌调查中的应用

荧光显微镜直接计数法在海洋细菌调查中的应用

荧光显微镜调查细菌总数是反映水体微生物污染的重要参数之一。过去，通过方法学原理，人们认为细菌在水生生态系统中的作用微乎其微。但近十几年来,海洋细菌的数量、生物量的研究广泛开展愈来愈受到海洋科学家的重视。荧光显微镜直接计数法快速、准确、简便,且样品易于保存,用于海水中细菌总数测定能较好反映各调查海域的细菌实际总量。笔者就粤东半封闭型海湾-柘林湾水样、泥样的细菌数量变化动态使用荧光显微镜进行调查。下面介绍该显微镜使用方法及在水样过滤操作上的一点改进,并对调查结果进行分析。1设备和测试剂1.1微孔中性滤膜(1)蔡斯(Zeiss)标准18显微镜,装有一个IV.FL上荧光聚光镜,一个100W卤素带通滤色片,一个510光束器和一个LP528阻挡滤色片。(2)0.45μm和0.2μm孔径,2.5cm直径的微孔中子滤膜。(3)Pall-Gelman2mm可换膜针头式滤器(5)20ml一次性注射器(6)浸润油,盖玻片和显微镜载玻片(7)100ml塑料瓶1.2特殊试剂(1)亚麻岩1g/L(2)伊galan黑水2g/L(3)甲醇溶液40%(4)无菌清洁水用前0.2μm滤膜过滤2分析2.1样品的持续研磨法测定样品总有效蛋白2.用采水器采集水样约100ml,加入40%甲醛溶液2～5ml,混匀并贮存于冷暗处,样品应在2周内分析,若样品立即进行分析则不需加甲醛。用曙光采泥器采集表层1～2cm底泥,混匀后取样5g,置于150ml锥形瓶中,加入45ml滤除细菌(经0.2μm滤膜过滤)的海水,剧烈振荡0.5h,之后取瓶中泥上层水样按2.2测定分析。所采泥样在60℃下烘干,以单位干重泥样所含细菌数表示底泥细菌数量。2.2细菌计数ss(1)将一片0.45μm的微孔滤膜放在膜滤器的烧结玻璃板上,在其上面再放一着色的中子滤膜,光泽面朝上。(2)装置好微孔膜装置,用夹将滤筒夹牢。(3)用水样洗涤一支5ml自动移液管并取1ml水样注入滤筒中(注意勿使移液管触及滤膜),加入0.2ml吖啶橙染料于水样中并轻轻倾斜装置使其混合,经染色3min(秒表计时)即在负压50kPa下滤去染液。之后,用无菌水沿滤器筒壁冲洗数次,再将滤液抽干。(4)卸下滤器,用镊子轻轻掀起湿滤膜移至洁净载玻片(已作好标记)上。于滤膜中央加一滴低荧光浸润油,放一盖玻片在油和滤膜上,轻压以使油分散并出去气泡。(5)载玻片可立即计数或存放与黑暗处不超过24h。将载玻片移至荧光显微镜下,放低物镜直到它刚接触滴在盖玻片上面的浸润油,打开显微镜灯并调节电压至最适宜状态。从目镜中观察,慢慢地将显微镜聚焦到细菌上。(6)至少随机计数10个视野的细菌数,每视野的细菌数一般以30～50个为宜;依下列公式计算水样中的细菌数(个/ml),用10个视野计数的平均值(X):E=X⋅S1S2⋅1VE=X⋅S1S2⋅1V式中:E为样品中细菌总数,个/ml;X为各计数视野细菌总数的平均值,个;S1为滤膜面积,mm2;S2为显微镜油镜的视野面积,mm2;V为过滤水样的体积,ml。(7)为避免污染随后的计数,在进行下一次分析前要用试剂洗涤全部过滤仪器。2.3实验装置考虑到微生物检测过程应严格按一般细菌学检测的无菌操作进行,而且所测定水样数量较少(1ml左右)。在无菌工作台旁放置一套抽真空泵装置,会给实验操作带来不便见图1(a)。改用Pall-Gelman25ml可换膜针头式滤器装置见图1(b),其体积小,所测定水样一般为5ml以下。在上述测定步骤(3)中改用注射器连接,可直接挤压活塞,其压力同样可以控制在50kPa,此操作极为方便,便于严格控制无菌条件下操作。3荧光显微镜细菌检测方法笔者就柘林湾水域展开微生物动态变化调查,其中站位分别为:黄岗河口、三百门、柘林港、贝类养殖区、渔排、湾口、湾外。两种水样过滤法以可换膜针头式滤器装置过滤水样与真空泵抽滤装置过滤水样,后按上述荧光显微镜细菌计数方法操作。测定结果见表1,表2。两方法分析结果表明,柘林湾水样细菌总数在1.72×107～2.64×107个/ml之间波动,底泥细菌总数变化范围为3.05×108～1.18×109个/g干重。这与刘国才、晏荣军等研究结果相近。对真空泵抽滤法及针头式过滤法所测结果进行方差分析,见表3,表4。水样单因素方差分析F=0.003764<F0.05=4.747221,两方法测定结果差异不显著;底泥单因素方差分析F=0.001355<F0.05=4.747221表明两方法测定结果差异不