胰岛素治疗1型糖尿病的研究进展

胰岛素治疗1型糖尿病的研究进展

1型糖尿病有很多原因，包括病毒感染、药物接触和自身免疫，最终导致胰岛纤维化细胞死亡，血清中胰岛素含量绝对不足，导致身体高血压。自1921年Best和Banting发现胰岛素以来,皮下注射胰岛素一直是治疗1型糖尿病的最主要手段。近年来随着胰岛素缓释泵技术及基因工程改造的长效胰岛素的广泛应用,1型糖尿病患者的血糖较以往得到了更有效的控制。但由于通过此类方法产生的胰岛素释放不受血糖调控,或者血糖释放不符合生理节律等,患者的血糖往往波动较大,且容易引起低血糖晕厥。在过去20年中,随着分子生物学技术的发展,科研工作者一直在尝试将胰岛素分泌细胞导入体内或将胰岛素基因直接转入体内,恢复体内胰岛素合成与分泌,并使之受血糖调控。本文将对1型糖尿病的新治疗方法做一简要回顾与综述,并重点讨论近年来研究的新进展及其临床应用的可行性。一、胰岛移植与干细胞技术(一)胰岛移植1991年,加拿大阿尔贝塔大学医学院完成了世界上首次人胰岛移植实验。在使用抗免疫球蛋白、糖皮质激素、咪唑硫嘌呤等免疫抑制剂后,成功地将纯化的人胰岛细胞和一个肾脏移植入一名具有25年糖尿病史的35岁患者体内。手术后的几个月内,患者完全摆脱了对外源胰岛素的依赖。尽管由于1型糖尿病患者体内存在针对胰岛细胞的抗体、机体自身的排异反应及免疫抑制剂对β细胞本身的毒害作用,接受胰岛移植的患者在几个月后又开始接受胰岛素治疗。但该手术的成功还是使人类在彻底根治1型糖尿病上迈出了历史性的一步,也为糖尿病患者彻底摆脱依靠每天注射胰岛素缓解病症带来了希望。在经过了近十年的探索后,阿尔贝塔大学医学院的Shapiro及其同事于2000年在最权威的医学刊物《新英格兰医学杂志》上报道:在使用不含糖皮质激素的一类包括sirolimus、tacrolimis及daclizumab在内的新型免疫抑制剂的条件下,将分离的人胰岛注射入糖尿病患者的肝门静脉内,可以使胰岛附着在肝窦区域并分泌胰岛素。接受这种胰岛移植的患者在平均11.9个月内(4.5~15个月)完全摆脱了对胰岛素的依赖(Shapiro等.2000)。虽然大部分患者在移植1年以后又开始接受外源胰岛素治疗,但所需的胰岛素剂量远低于没有接受胰岛移植的1型糖尿病患者,同时血糖也得到更有效的控制。在随访中,研究者发现接受了胰岛移植的患者不依赖胰岛素的时间最长已经超过了5年,而少数患者体内的移植胰岛在超过6年以后仍然发挥功能并能相对有效地控制血糖。由于阿尔贝塔大学位于Edmonton市,所以这种胰岛移植的新方法又被称为Edmontonprotocol。这一里程碑式的研究为最终根治1型糖尿病带来了新的希望,第一次真正使得接受了胰岛移植的糖尿病患者在相当长的时间内完全摆脱了对胰岛素的依赖,极大地提高了患者尤其是已经有并发症的患者的生活质量。近年来,不断深入的研究提示Edmontonprotocol还有许多需要进一步改进之处,包括sirolimus(rapamycin)对β细胞的毒性作用、胰岛用量相对较大及纯化过程的胰岛应激损伤等。此外,目前胰岛移植方法面临的主要困难还包括同源胰岛来源困难、移植后胰岛存活率低、免疫抑制剂的副作用及移植成本高昂等。(二)干细胞在治疗1型糖尿病中的作用用干细胞治疗糖尿病,具有永久性摆脱外源性胰岛素依赖、恢复生理性的胰岛素分泌调控等优点,同时还因为胰岛干细胞来源于自身细胞,能消除或减低免疫排斥的程度,且不受社会伦理方面的制约。胰岛干细胞目前可由胚胎干细胞、成体干细胞得到,其中成体干细胞包括胰腺导管上皮细胞、巢蛋白(nestin)阳性胰岛前体细胞,肝脏干细胞、其他组织干细胞的转分化或基因工程技术改良得到。Ramiya等从尚未发病的NOD鼠的胰腺导管上皮细胞诱导分化得到“产胰岛干细胞”(islet-producingstemcells,IPSCs)又称“产胰岛素的胰岛样细胞团簇”(insulin-producingislet-likeclusters,ILCs),在体外培养分化了3年后,这些团簇样细胞可低水平地分泌胰岛素及其他胰腺内分泌激素,体内移植实验证明这些分化来的胰岛样细胞能有效地控制NOD小鼠的血糖。Bonner-Weir等从人的胰腺组织诱导分化出胰岛样细胞团(culturedhumanisletbuds,CHIBs),这些细胞中能检测到细胞发育因子19(cytokeratin-19,CK-19)阳性的导管细胞和胰岛素阳性的胰岛细胞。免疫组化能证明这些细胞含有胰岛细胞及其同源细胞群,且这些细胞具有葡萄糖反应性胰岛素分泌功能和自我增殖分化为胰岛样组织的能力。此外,也有研究表明大鼠及人的胰腺中存在着一种表达nestin的胰岛前体细胞,即nestin阳性的胰岛前体细胞(nestin-positiveislet-derivedprogenitorcells,NIPs),其不表达导管细胞标志CK-19,也不表达成熟胰岛细胞标记,但表达胰岛细胞早期分化的重要标志PDX-1。在体外培养中,这些细胞可被诱导表达胰岛素、胰高血糖素。这些细胞可以形成ILCs,尤其是在胰高血糖素样肽-1(glucogan-likepeptide-1,GLP-1)的刺激下,这种胰岛化团簇的趋势更加明显(Zulewski等.2001)。一直以来,人们普遍认为成体干细胞的分化潜能很弱,但近年来的研究表明,成体干细胞的横向分化具有普遍性。Yang等发现从小鼠肝脏分离培养的细胞在体外可以被诱导分化为ILCs,将这些细胞移植入链脲霉素诱导的1型糖尿病小鼠体内,能逆转其糖尿病表型。体外培养的未成熟大鼠的小肠干细胞(immatureratintestinalstemcells,IEC-6),在特定的培养条件下可表达PDX-1,将这些细胞植入NOD小鼠体内,可显著降低血糖水平(Kojima等.2002)。2006年,Yamanaka领导的科研小组在干细胞分化领域取得重大突破。他们利用病毒技术将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4基因导入人上皮细胞中,可将其诱导为具有全向分化功能的全能干细胞,强烈提示这一技术可能在治疗包括糖尿病在内的多种重大疾病中起无法估量的作用。二、基因疗法简介基因疗法是近十几年来伴随着现代医学与分子生物学相结合而诞生的。它是指将正常的功能基因或新基因以一定的基因转移方式导入患者体内,表达出患者体内缺失或表达异常的蛋白,重新赋予其正常的或新的生理功能。基因疗法采用的基本方法有(1)基因校正(Genecorrection):纠正致病基因的异常碱基;(2)基因置换(Genereplacement):通过基因同源重组,以正常的基因代替致病基因;(3)基因增补(Genecompensation):表达出蛋白来补偿缺陷/或缺失基因的功能或加强原有的功能;(4)基因失活(Geneinactivation):将反义核酸导入细胞,阻断某些基因的异常表达。(一)再生基因与β细胞再生由于1型糖尿病大多是由于自身免疫攻击β细胞引起的,移植进入体内的胰岛及干细胞移植在目前看来还是不能逃避免疫系统的攻击,所以其目前还不能从根本上治愈1型糖尿病。近年来,刺激体内残存β细胞再生或其他细胞分化为β细胞,逐渐成为研究的热点之一。再生基因(regeneratinggene,Reg)由Terazono等首先发现,它编码一个由165个氨基酸组成的小分子蛋白。Reg基因只在再生的胰岛细胞中表达,而在正常的胰岛细胞中不表达。近年的研究发现,Reg蛋白作为一种引起胰岛β细胞再生的生长因子,可被白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)及糖皮质激素等炎性因子激活表达,通过自分泌或旁分泌的方式作用于细胞表面的Reg受体,刺激β细胞增殖,缓解糖尿病症状。目前对于Reg蛋白诱导β细胞再生的具体机制尚不清楚。有研究表明,Reg可增加细胞内的磷酸化-ATF-2水平,激活细胞周期蛋白D1(cyclinD1),但这一过程能被LY294002和wortmannin等PI3K抑制剂阻断。在Reg基因敲除的小鼠胰岛中,磷酸化-ATF-2、cyclinD1和磷酸化Rb基因的表达水平均显著下调。此外,在Reg基因敲除的小鼠中,胰岛β细胞中γ-32P-ATP的掺入减弱。使用硫代葡萄糖金诱导胰岛增殖后,Reg基因敲除的小鼠胰岛要明显小于对照组。这些结果提示,Reg/Reg受体途径可能通过PI3K/ATF-2/cyclinD1信号传导通路诱导细胞再生。在转有Reg基因的小鼠胰岛β细胞中,γ-32P-ATP的掺入能力显著提高,β细胞的增殖能力明显增强。此外,在NOD小鼠中转入Reg基因后,其糖尿病的发病进程较对照NOD小鼠明显减缓。另有研究表明Reg能激活大鼠胰腺导管细胞和RNI1046-38细胞中蛋白激酶磷酸化酶(proteinkinasephosphatases,MKP-1)和cyclinD1的表达,从而促进胰岛β细胞的有丝分裂,但高浓度的Reg却能与MKP-1结合,通过抑制MKP-1的表达抑制细胞生长,促进细胞凋亡。总之,现有的研究表明,通过调控Reg基因刺激β细胞再生有可能成为治疗1型糖尿病的新靶点。(二)胰岛素基因的直接导入在胰岛素原向胰岛素转变过程中,2个内切蛋白酶PC2和PC3起关键作用。PC3识别B链与C肽连接处的Arg-Arg序列,PC2的识别序列是C肽与A链之间的Lys-Arg。由于除胰岛β细胞外的其它细胞中不表达这两种蛋白酶或表达水平相对很低,通常情形下胰岛素的加工、成熟及分泌只能在胰岛β细胞中完成。若要使外源性的胰岛素原在非β细胞中转化为成熟的胰岛素,就要对外源DNA进行一些改造。由于furin内切蛋白酶存在于多种非胰岛β细胞中,如果能将胰岛素A链与C肽或B链与C肽连接处改造成furin酶切位点,这样外源性胰岛素原就能在非胰岛β细胞中加工、成熟并分泌。因此,直接将胰岛素基因转入体内的非胰岛β细胞中,并使得胰岛素能在这些细胞中加工分泌一直是糖尿病基因疗法的重要突破点。1.胰腺基因检测病毒载体作为转基因的载体应具备的基本条件包括:(1)具有携带外源基因并能组装成病毒颗粒的能力;(2)可介导外源基因转入和表达的能力;(3)对机体无明显的毒害作用。当前最常用的转基因病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、单胞症病毒、逆转录病毒及慢病毒等。Kolodka等用逆转录载体将胰岛素基因I定向表达于大鼠肝脏,可产生活性胰岛素并使血糖浓度恢复到正常水平。Sugiyama等将含有胰岛素基因的腺相关病毒注射到糖尿病小鼠的肝组织中,小鼠血糖浓度显著降低并至少能维持5天,同时血清胰岛素浓度显著上升。Dong等利用腺病毒载体将胰岛素原基因定向在糖尿病大鼠的肝脏表达,使大鼠血糖恢复到正常水平并伴随血清中的胰岛素浓度上升。Lee等用一段7个氨基酸的小肽(Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg)替换胰岛素原基因中的C肽,体外受体结合及活性实验分析表明,该胰岛素类似物具有20%~40%的胰岛素活性,而胰岛素原只具有2%~3%的胰岛素活性。用腺相关病毒载体将这个胰岛素类似物基因转入糖尿病小鼠肝中,能使小鼠血糖恢复到正常水平并保持长达8个月(Lee等.2000)。Lee等实验成功的基础就是使这个胰岛素类似物基因表达时不需要加工,而具有较高的胰岛素活性。其它研究也进一步确认利用腺相关病毒及慢病毒将胰岛素基因转入小鼠肝脏后,能有效地控制糖尿病小鼠的血糖,并受血糖及代谢产物的调节。Oh等发现将带有胰岛素基因的慢病毒注入小鼠下肢骨骼肌中,也能有效地降低血糖并改善糖尿病症状。虽然各种病毒载体有诸如免疫反应、干扰正常细胞周期及致癌性等种种缺点,但随着这些缺点正在不断地被克服,它们将离真正的临床应用越来越近。2.在骨骼肌和电渗肌之间的基因融合Morishita等将含有人胰岛素基因的质粒用脂质体包埋后从尾静脉注射到STZ诱导的糖尿病小鼠体内,血糖显著降低并能维持超过14天,同时能在小鼠肝和脾等部位检测到人胰岛素,反复的尾静脉注射基因能使低血糖水平维持四周以上(Morishita等.2000)。Bartlett等首先发现直接将裸DNA注射到肌肉中,肌纤维细胞能分泌活性胰岛素,这为选择肌肉细胞作转基因靶细胞提供了重要依据(Bartlett等.1998)。Kon等将含有人胰岛素基因的质粒直接注射到糖尿病小鼠的骨骼肌内,在注射质粒后的第七天,可以在血清中检测到胰岛素的浓度增加了3.6倍,同时伴随着血糖浓度的降低。两次注射能显著地降低小鼠血糖(Kon等.1999)。但由于将裸DNA注射于骨骼肌中,表达质粒进入细胞的效率非常低,因此在随后的研究中逐渐将DNA注射与电穿孔结合起来,以提高基因转入效率。在前期研究中,Yang等将人胰岛素原基因进行了改造,在其C肽与A链及B链的连接处引入了一个Furin酶切位点,以使改造基因能在非胰岛β细胞中加工成熟(图1)。将含有人前胰岛素原基因的质粒采用多点注射的方式注射到STZ诱导的1型糖尿病小鼠及大鼠的腿部骨骼肌内,再在注射部位施加一个电脉