犬细小病毒病诊断技术 编制说明

1征集国家标准制定计划中。由全国动物卫生标准化技术委员会围绕动物疫病防控、动物产品卫生、动物卫生监督、动物疫病诊断、动犬细小病毒（Canineparvovirus,CPV）是引起犬科或其它食肉为犬的两种最重要的病原，常引起犬严重地出血性胃肠炎、呕吐及脱水等症状。各年龄段犬均易感，幼犬的易感性最高，可引起幼犬的心肌炎；成年犬发病率和死亡率较低，主要表现出血性肠炎症状。随着我国犬、水貂、狐狸等大型养殖场的建立，在犬和毛皮动物中细小病毒感染的数量迅速增加，目前细小病毒病已成为危害养犬业强，发病急，传播快，一旦发病，难以有效地治疗和控制，易造成变异，各种突变毒株大量出现，对于新型突变株的适时监测和深入2本标准由中华人民共和国农业农村部组织，归口单位为全国动物卫生标准化技术委员会，起草单位为青岛农业大学、逢时（青岛）海洋科技有限公司、中国动物卫生与流行病学中心、青岛海华生物集团股份有限公司、青岛市城阳区农业农村服务中心、河北北方学院、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、青岛巴特菲科技发张洪亮：青岛农业大学，主持标准修订、编制及实验室研究的王媛媛：中国动物卫生与流行病学中心，负责病毒分离鉴定方刘刚：青岛海华生物集团股份有限公司，负责标准的整体把握；李明义：青岛海华生物集团股份有限公司，负责血凝与血凝抑周芳：逢时（青岛）海洋科技有限公司，负责标准资料查询汇李健：上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，负责标准文3徐超：逢时（青岛）海洋科技有限公司，负责标准资料查询汇张传美：青岛农业大学，负责标准资料查询汇总、组织协调等刘丽蓉：中国动物卫生与流行病学中心，负责胶体金检测方法林佳旭：青岛农业大学，负责标准文本的整理、数据归纳及标要按标准各阶段为单位分别编写。列出各阶段的关键内容。征求意见、审查阶段的主要内容要详细给出。征求意见要对征求对象的代表性、回复情况、45能够在规定时间内完成。本标准犬细小病毒病诊断技术的对象合理、名称规范、主要技术内容具有可操作性和先进性，标准结构合理、标准的制定程序符合相关的法律法规。本标准语言表述思路清晰、易懂，内容清楚、准确，结构、文体、术语具有统一性，试验步骤合理、简洁，且相关技术完善、成熟，诊断方法客观、实用性强，6结果分析明确。本标准在制定过程中坚持科学、实用、严谨和先进。首先坚持科学至上的原则，广泛收集国内外文献资料，选择要建立的检测技术，通过实验室反复多次检测，对标准所列试验方法进行验证，对得出的试验结果、数据进行科学的统计分析，完善标准草案，并征求国内相关各行业专家意见，力求制定出科学、高效的标准；其次坚持实用性原则，选择的检测方法不必为行业内最先进的技术方法，但一定要符合行业实情和技术要求，并能够在动物疫病防控相关兽医实验室应用，验证出标准可操作性、实用性；最后坚持标准先进性原则，在标准制定过程中，参考最新国家标准及相关法律法规，在国际标准对于我国国情适用的情况下，可选择参考先主要内容包括技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则等。本标准的流行病学特征、临床症状及病理学变化等方面内容参学》中关于犬类犬细小病毒病的内容，同时参考我国近些年发表的本文件代替GB/T27533-2011《犬细小病毒病诊断技术》，与——增加了规范性引用文件（见2——增加了流行病学特点（见6.17——增加了荧光定量PCR检测（见9——增加了胶体金试纸检测（见10——修改了术语和定义（见3三、主要试验或验证的分析、综述报告，技术经济论证，预期早期症状是精神低落，食欲不振，呕吐，高热和严重腹泻。患病犬体温在初始阶段略有上升，但逐渐转向低于正常水平。排泄物有时为水样稀粪或黄色粪便，严重时为血便。由于呕吐和腹泻造成犬严重脱水会危及生命，通常在出现症状3天后，患病犬就会死亡。CPV的发病率和死亡率随着动物的年龄、疾病的严重程度和其它并的小狗最易表现此症状。当给予8周龄小狗一个可以感染的剂量，8续数月或几年。幼犬心肌炎最显著的表现是4周龄时突然死亡。死亡时往往四肢冰冷，抽搐，黏膜苍白，不停的喘息。急性心脏衰竭犬易表现出亚急性心脏衰竭症状。病犬腹部肿胀，腹水掺杂有血液。有时会心跳加速，有时心率不齐，多数死于心源性休克。即使病犬耐过也会患上慢性心肌炎和循环系统并发症。这时不会有腹泻发生，肠道疾病中，病变可能分段的分布在整个胃肠道。通常在空肠和回肠可见明显病变，而在十二指肠和结肠则观察不到。被感染的肠段会松弛并且浆膜下会充血或出血。肠管通常是空的或充满了水样消化物，肠系膜淋巴结会水肿变大，白细胞大量减少。在感染的急性期，淋巴结切面会有大面积出血灶。胸腺皮质坏死和萎缩在幼犬中在心肌炎病例中，尤其是左心房和左心室肿胀明显，虽然肺脏不会衰竭，但是支气管中充满了白色泡沫样液体。心机表面有纵横的2.荧光定量PCR检测2.1.病料的采集及处理采集的样品包括犬的泪液、鼻液唾液、粪便及病死的肝脾肺等组织器官。将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆30009水浸润后，取上清液待检。经细胞病原分离培养的样品，收集细胞2.2.1荧光定量PCR检测方法的建立VP1-P:5’-(FAM)TGGAGCAGTTCAACCAGACGG(BHQ)-3’利用商品化PCR试剂盒，加入探针和引物，组成荧光定量2.2.2标准曲线的建立2.2.3敏感性试验2.2.5重复性试验2.3.1荧光定量PCR检测方法的建立2.3.2标准曲线的建立按上述优化的反应条件，选择3.4×108、3.4×107、3.4×106、Fig.3-1ThecurveofFQ-PCRFig.3-2StandardcurveofFQ-PCR31.25，其他均无扩增曲线和CT值，表明该方法特异性好，只能扩2.3.5重复性试验犬细小病毒抗原快速诊断试纸其操作简便快捷、结果较为精准，的进出口普检及疫病的普检。是目前临床上快速诊断犬细小病毒病用生理盐水沾湿的棉签从直肠取样或直接从新鲜粪便取样。将棉签浸入到装有样品稀释液的试管，充分搅拌混匀10-20min后判读结果，30min后指示无效。对照线（C）和检测线（T）均显色为阳性；仅有对照线（C）显色为阴性；对照线（C）CPV感染的快速诊断用于隔离受感染的犬和预防易受干扰的其它接触动物的继发性感染是十分重要的，临床诊断有时是不准确的，因为其他一些病原体也可能会引起犬腹泻，如冠状病毒，腺病毒，麻疹病毒，轮状病毒，呼肠孤病毒等，因此，临床病例应通过实验是采集粪便或肠内容物用于实验室检测。但是在感染的晚期阶段，然而，他们的敏感性，已被证明不如分子检测。与分子检测技术相比，免疫色谱（immuno-chromatographic，IC）方法相对灵敏度不超低是因为在感染的晚期病毒粒子脱落的数量减少，或者在感染早期由于抗体滴度较高，大量病毒粒子被抗体中和导致。最近的研究将用于CPV抗原快速检测的三种不同的基于抗体的诊断试剂盒与PCR和免疫电子显微镜方法进行比较，确认了抗体诊断试剂盒具有血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI）只能在专业实验室里操作，且需要新鲜的猪红细胞或猫或恒河猴的红细胞，但这些红细胞要么很难获得所需数量，要么价格昂贵。而且，已有报道称某些20世纪末，免疫胶体金标记技术已广泛应用于抗原抗体检测反应，尤其在人类医学上取得了较好的效果。近几年来随着该技术的不断发展，胶体金快速检测试纸条广泛应用于兽医临床，王中力等2分子生物学诊断虽然分子生物学方法一般不受宿主免疫系统影响，但它们通常酸探针杂交技术已被证明是特异可靠的，重组DNA技术制备的他们的灵敏度和特异性毋庸置疑。刘维全等建立了检测肉食兽细小床送检样品检测证实了本法对肉食兽细小病毒通用且具有快速特异出率，降低检测成本，一种新型敏感、特异、快速、简便、实用的可视化环介导等温扩增(LAMP)技术被建立应用。杨慧等于2010年min，具有良好的特异性，与同属的其它病毒无交叉反应，对CPV好等优点，可以对发病早期或潜伏期的样品准确定量判断[35]。其形式呈现出来，便于直观判断，不需要人为的后续处理，方便了临目前常用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。荧光探针的两端分别连有荧光发光集团和荧光淬灭集团，当两者同时存在时，由于受到荧光淬灭集团的限制，荧光发光集团不发光。但是放出，这时淬灭集团失去了效用，荧光通过发光集团产生，随后这些光信号被机器收集，从而对目的基因进行定量。探针法特异性更高，因为探针只会与设计的目的片段发生结合，只有结合有探针的双链目的片段才能发出信号，这就对探针的特异性提出了更高的要求，通常所设计的探针必须能准确高效的结合目的基因，能最大限度降低其他非特异扩增的干扰。此外，由于探针的设计可以人为控制，能提前优化反应条件，可以最大限度的满足扩增要求。探针法最大的是缺点是探针合成成本高，需要特殊的荧光定量PCR仪；点是存在特异性不强和非特异信号干扰，因此，不适合于临床诊断。从目前国内对犬细小病毒的研究概况来看，犬细小病毒的研究和关注相对较少，且国内对其研究起步较国外晚。在病原分离上，技术已经相对成熟，细胞培养可以在临床上用于病毒分离。在临床诊断方面，现有的检测方法主要有胶体金试纸检测、荧光定量PCR检测、PCR检测等。在防控方面，国内也生产了一些主动免疫生物制剂，如灭活苗和弱毒苗，并且与犬瘟热病毒、犬冠状病毒及犬腺病毒等其它弱毒株一起制备联合弱毒疫苗。因此，本标准的制定能构建快速、灵敏、可靠的犬细小病毒病诊断技术标准不仅能保障犬类养殖过程中的生物安全问题，也可有效诊断犬细小病毒，确保我国犬类养殖业的稳定、健康、可持续发展。犬细小病毒对外界环境具有很强的抵抗力，且传播途径复杂，对我国犬养殖业造成严重危害，经济损失巨大，建立犬细小病毒病诊断技术规程，规范此类疾病诊断过程，有利于对该病的流行病学调查、诊断和监测，可大幅降低对我国犬类养殖业所造成的经济损失，促进我国养殖业的健康发展。加强对疾病的防控、研究，对犬类保护和促进我国犬类四、采用国际标准和国外先进标准的程度，以及与国际、国内本标准内容未采用国际和国外先进标准。与国内标准GB/T27533-2011《犬细小病毒病诊断技术》对比分析，本标准在实验室方法及样品采集处理部分较相关标准更加详细、完善；综合性主要说明标准与相应法律法规和强制性标准之间的衔接、协调情况。列出本标准原则上严格遵循国家相关法律法规制定。相关法律法规说明各方面专家对标准主要内容（如参数、指标、试验方法）有哪些重大分歧，以及标准起草单位在修改完善标准过程中，对专家分歧意见的处理主要七、标准性质（强制性，推荐性）的建议，特别是对建议批为严格按照立项下达的性质编写。无需增加解释文字。