20世纪70年代以来中国人疫苗学与免疫学的诞生

20世纪70年代以来中国人疫苗学与免疫学的诞生

在古代，中国人通过注射天花患者的脓液来预防疾病。这种类型的天花是在18世纪初通过土耳其移植的。与此同时,英国乡村医生琴纳发现挤牛奶女工不会患天花,于是他改进了接种方法并取得了人体试验的成功。疫苗学与免疫学由此诞生。20世纪50年代以后,进入了疫苗发展的多产期。这个时期的疫苗主要是全细菌疫苗、细菌组分疫苗、病毒重组亚单位疫苗、体外培养的活病毒疫苗以及灭活病毒疫苗。20世纪70年代末,Adam等发现了口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus,FMDV)中两个具有免疫活性位点的序列肽段,从而找到一种新型疫苗——多肽疫苗。80年代初,Lerner提出通过确定天然抗原结构寻找抗原决定簇氨基酸序列,合成同时具有抗原性和免疫原性的多肽,建立了发展合成多肽疫苗的方法。与常规的基于灭活病原体、亚单位及重组疫苗相比,多肽疫苗的优势在于:具有诱导对蛋白抗原的结构元素(在完整的抗原分子中表现出弱免疫原性的结构)免疫应答的能力;生产技术安全;高度标准化;缺乏具有高反应原性的成分(脂多糖、毒素);存在去除对免疫个体本身分子具有致敏性和交叉反应活性抗原片段的可能性;有可能将不同抗原得到的各种多肽结合在一种载体中;能够针对复杂的非连续性天然抗原决定簇,构建相应的合成抗原多肽。多肽疫苗的这些优点使其成为新一代疫苗研究的热点之一。目前已有数种多肽疫苗进入各期临床研究阶段,包括抗病毒多肽疫苗、抗癌多肽疫苗、抗疟疾多肽疫苗和抗生育多肽疫苗等。1抗感染疫苗1.1疫4x肽vacc-4x多肽疫苗的制备和鉴定获得性免疫缺陷综合征(TheAcquiredImmunodeficiencySyndrome,AIDS)极有可能在非洲存在了很长时间。1981年,随着美国的同性恋人群爆发间质性浆细胞肺炎,首次在美国的同性恋人群发现该病。AIDS由HIV引起,通过性接触、注射被感染的血液或血液制品和母婴途径传播病毒。开发高效多肽疫苗的最大挑战是人群中HIV-1的多样性。HIV-1基质蛋白(MatrixProtein,p17)作为HIV-1中和抗体的靶位之一,其抗体水平高低与AIDS发展程度相关,是AIDS治疗性疫苗的候选抗原之一。来源于HIV-1病毒株BH10的p17功能性表位,是由20个氨基酸残基(SGGELDRWEKIRLRPGGKKK)组成的合成多肽,命名为AT20,结合载体钥孔血蓝蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin,KLH)后形成AT20-KLH复合物。采用AT20-KLH对非洲人HIV-1两种亚型所含p17蛋白进行评价,结果表明,AT20-KLH通过识别高度保守的构象表位,中和来自不同菌株的p17生物活性。疫4x肽(Vacc-4x)多肽疫苗由四个基于HIV-1核心蛋白p24保守区域构建的水溶性合成多肽组成,肽链长度介于20~27个氨基酸残基之间。IIB期多中心、随机、双盲临床试验对比了HIV-1感染者使用Vacc-4x与安慰剂的效果。首要目标是比较给药24周内的CD4计数差异,次要目标包括安全性、病毒载量和免疫原性。18个临床中心13个位于欧洲、5个在美国,总计135位患者中,有126位患者完成了试验。试验组和安慰组的CD4计数差异无统计学意义(P=0.12)。试验组和安慰组的病毒载量之间差异有统计学意义(P=0.0022)。结果发现,Vacc-4x有良好的安全性和耐受性;与对照组相比,Vacc-4x受试组在试验期间显著降低了病毒载量。监督管理当局和绝大多数临床专家认为,对临床治疗HIV患者病毒载量的影响比CD4+细胞计数更为重要。这一发现可能成为Vacc-4x作为治疗性HIV疫苗的研究基础。1.2赛拉第姆—乙型肝炎(乙肝)病毒(HepatitisBVirus,HBV)多肽疫苗乙肝由HBV引起,以肝脏为主要病变,并可累及多器官损害的一种传染病。被世界卫生组织(WHO)列为要加强控制的传染病。乙肝在世界各地都有不同程度流行。我国是乙肝的高发区,2006年调查全国1~59岁人群乙肝病毒表面抗原(HBVSurfaceAntigen,HBsAg)携带率为7.18%,全国1~59岁人群抗乙肝病毒表面抗原抗体阳性率为50.09%。接种乙肝疫苗(HepatitisBVaccine,HepB)是预防和控制乙肝的最有效的措施之一。赛拉第姆(Theradigm)-HBV是一种诱导HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTLymphocyte,CTL)反应的脂肽疫苗,治疗慢性HBV感染,主要含有针对乙肝病毒核心抗原(HBVCoreAntigen,HBcAg)的CTL表位——核心抗原f18-27的多肽(HBcAg18-27)、来源于破伤风类毒素(TetanusToxoid,TT)的辅助性T细胞(HelperTLymphocytes,HTL)表位——TTf830-843的多肽,以及两个棕榈酸分子。I期临床试验结果发现,Theradigm-HBV诱导明显的HBV特异性CTL应答,但免疫原性较弱,不能成为治疗性多肽疫苗。国内有学者亦利用相同的针对HBcAgf18-27的CTL表位及针对前S2区(Pre-S2)的B细胞表位,联合HTL构建疫苗在巴比赛(H-2d)[Balb/c(H-2d)]小鼠中诱发了55.3%的CTL杀伤活性,同时外周血单核细胞中uf067干扰素(Interferonuf067,IFN-uf067)分泌细胞显著增生。提示该疫苗可能会在HBV的治疗中起一定作用。目前该研究正在进行Ⅱ期临床试验。1.3ic21肽疫苗immonecoper-tHCV全球感染率为1%~3%,有1.7亿感染者。我国感染率3.2%,有3800万感染者。由于HCV感染T细胞反应微弱,且被膜抗体在慢性感染患者和动物试验中不能产生相应的中和反应,Firbas等设想建立由表位特异性CD8+CTLs和CD4+反应所致的抗HCV免疫应答效果会更佳,若使用特征性表位包括大部分组织相容性白细胞抗原位点A(HistocompatibilityLeukocyteAntigenLocus-A2,HLA-A2)限制性表位的疫苗也将更具优势。基于上述假设合成的免疫复合物41(ImmuneComplex41,IC41)肽疫苗便具有这一特性。IC41肽疫苗是奥地利IntercellAG公司与美国Romark公司合作开发的治疗性疫苗候选物。IC41由5个合成多肽[2个片段(f23-44和f132-140)来源于核心蛋白,2个片段(f1073-1081和f1248-1261)来源于非结构性蛋白(Non-structuralProtein,NS),1个片段(f1764-1786)来源于NS4],以及刺激多肽抗原穿透进入细胞的合成聚L-精氨酸佐剂组成。这些多肽包括3个CD4+HTL表位(核心蛋白片段f23-44,NS3片段f1248-1261,NS4片段f1764-1786)及4个HLA-A2特异性CTL表位(核心蛋白片段f35-44和f132-140,NS3片段f1073-1081,NS4片段f1764-1772)。片段f35-44、f132-140、f1248-1261、f1764-1772在多种HCV基因类型中序列保守,其序列一致性在1a、1b和2亚型中不低于87%。I期临床试验结果显示,IC41疫苗在健康人体内诱导形成HCV特异性CD8+T细胞,并且患者有良好的耐受性;接种剂量越高,免疫应答越强;针对特异性的辅助性T细胞第一亚类(THelper1,Th1)/杀伤性T淋巴细胞第一亚类(CytotoxicTCell1,Tc1)型免疫必须使用多聚精氨酸。II期临床试验对HLA-A2阳性的慢性丙肝患者6次给药,给药间隔4周,未见HCV核糖核酸(RibonucleicAcid,RNA)减少;但发现25%患者HCV特异性CD8+T细胞增加。1.4ipv6-16和pv-65重组疫苗点宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一。全球每年约27万女性死于宫颈癌,中国每年新发现13.15万病例。目前已经发现HPV是宫颈癌及其他HPV相关恶性肿瘤发病的病因。已鉴别100多种HPV,高危类型包括16、18、45、31型,低危类型包括6、11型。其中HPV-16和HPV-18与宫颈癌关联最为密切,占宫颈癌的75%,甚至有报道称达到85%,是发展预防性和治疗性HPV疫苗的研究重点。东京大学的研究人员开发了一种鼻腔给药的预防性L2合成多肽疫苗。I期临床研究13名健康志愿者,结果发现该疫苗安全、耐受性良好。5名接受高剂量的受试者中,有4位产生HPV-16和HPV-52的抗体。但低剂量给药组未产生免疫作用。疫苗免疫治疗提供了一种引人注目的替代疗法,这种疗法能作用于相关HPV感染以及可见病变,针对所有HPV关联的扩散诱导长期免疫力,从而防止复发。Muderspach等对E7基因编码的f12-20多肽进行I期临床试验,结果发现HPV-16多肽疫苗有重要的生理及临床作用,并对未来如何改进刺激抗原特异性免疫提出建议。未来多肽疫苗可能会针对重叠长肽进行发展。一种由13个多肽组成的重叠长肽疫苗(9个E6及4个E7表位多肽)加二缩甘露醇单油酸酯(MontanideISA-51)佐剂进行了多项临床试验。由11例HPV-16阳性的外阴上皮内瘤样病变(VulvarIntraepithelialNeoplasia,VIN)3级患者组成的I期临床试验中,患者皮下给药该重叠长肽疫苗4次,每次给药间隔3周。有4例患者免疫诱导HPV-16早期蛋白6(EarlyProtein6,E6)和E7特异性CD4+和CD8+T细胞并产生完全的扩散清除。另一项针对该疫苗的由43例晚期宫颈癌患者组成的I期临床试验结果表明,该疫苗安全、耐受性好,引发患者广泛的IFN-uf067关联的T细胞应答。同样的疫苗疗程用于检测子宫颈癌第一期B1(IB1期)HPV-16阳性宫颈癌患者,结果表明所有6例患者的HPV-16特异性CD4+和CD8+T细胞均增加,产生广泛的表位应答。该疫苗的II期临床试验包括20例HPV-16阳性的VIN3级患者,重叠多肽疫苗在所有患者中均产生T细胞应答,在追踪调查的12个月内,19例可评价患者中有15例产生客观的临床反应,其中包括9例产生完全反应,并在随后的24个月内完全治愈。重叠多肽疫苗的良好临床试验结果,对治疗性HPVE6/E7多肽疫苗的前景保持乐观。2抗感染多样性疫苗2.1免疫原性试验gp100黑色素瘤又称恶性黑色素瘤,是来源于黑色素细胞的一种高度恶性肿瘤,占恶性肿瘤比例约1%~3%。免疫治疗针对黑色素瘤形成机制,通过加强肿瘤微环境的免疫能力从而控制黑色素瘤细胞,成为目前相关研究的热点方向。黑色素瘤相关蛋白100(MelanomaAssociatedGlycoprotein100,gp100):209-217[210蛋氨酸(Methionine,M)]多肽疫苗是一种合成多肽疫苗,包括gp100f209-217的黑色素瘤抗原,其中210位被蛋氨酸残基取代以提高免疫原性。可以刺激宿主免疫系统,针对肿瘤细胞表达的gp100产生CTL响应。Ⅱ期临床试验中,转移性黑色素瘤患者接受高剂量的白细胞介素2(Interleukin,IL-2)联合gp100:209-217(210M)多肽疫苗,比单用IL-2的患者有着更高的反应率。这个试验验证了使用黑色素瘤疫苗和IL-2联合使用,作为免疫活化剂能够提高治疗效果,临床响应达到42%。为了进一步研究gp100:209-217(210M)联合大剂量IL-2治疗转移性恶性黑色素瘤,美国印第安纳大学的Schwartzentruber等开展了一项Ⅲ期多中心随机临床试验。该试验的纳入标准为:IV期或局部病灶晚期皮肤黑色素瘤,HLA-A0201阳性,无脑部转移,适合高剂量IL-2治疗的患者。患者被随机分为IL-2单药治疗组[每剂量为72万国际单位/公斤体重(IU/kg)]和联合治疗组,联合组用药方法为每周期给予一次gp100:209-217(210M)及不完全弗氏佐剂(MontanideISA-51),然后使用IL-2。首要观测指标为临床反应率,次要观测指标包括毒性反应和无进展生存。两组患者的基线数据匹配,并且每个治疗周期接受相同剂量的IL-2。结果发现,治疗出现的毒性反应与预期的IL-2治疗一致。联合治疗组的总体反应率比单药治疗组高(16%比6%,P=0.03),并且无进展生存期也较长,两者分别为2.2个月和1.6个月,P=0.008。联合治疗组的平均总生存也比单药治疗组长,分别为17.8个月和11.1个月,P=0.06。从以上数据可以看出,对于晚期黑色素瘤患者使用疫苗和IL-2联合治疗,比单用IL-2治疗有更高的反应率和更长的无病生存时间。2.2gv2001对肺癌细胞转移酶活性的影响胰腺癌作为十大恶性肿瘤之一,是常见的难治恶性肿瘤,根治性切除术后还有高复发和转移率。疫苗治疗成为解决这一问题的方法之一。GV1001是一种可以激活免疫系统的II类端粒末端转移酶多肽疫苗,能同时激活CD4+和CD8+T细胞应答,使其识别和杀死肿瘤细胞。端粒末端转移酶在正常细胞中极少存在,但在肿瘤细胞中过度表达。端粒末端转移酶活性被认为与肿瘤细胞不会正常死亡有关,这是所有肿瘤的一个共同特点。理论分析认为,GV1001可能成为一个通用的肿瘤疫苗。在一项调整剂量的I/II期临床试验中,接受中等剂量GV1001多肽疫苗治疗的胰腺癌患者,与低剂量组和高剂量组相比,显著提高了生存率,分别对应为8.6个月、4个月和5.1个月;中剂量组内免疫应答者的中位生存率为7.2个月,而无应答者为2.9个月。2011年11月公布的Ⅱ期临床结果表明,端粒酶GV1001多肽疫苗在治疗Ⅲ期非小细胞肺癌(StageIIINon-smallCellLungCancer,NSCLC)方面具有良好的耐受性,多数NSCLC患者产生免疫作用,并建立了持久的T细胞记忆。3fps.f06f6早在上世纪80年代就开始了3个方面的抗疟疾多肽疫苗研发:针对子孢子或肝内期疟原虫,针对血中无性生殖阶段的疟原虫,针对配子体、配子或蚊体内后期的疟原虫。Patarroyo制备的疟疾杂合亚单位疫苗Spf66是一种合成多肽的多聚体,包括4种不同的表位:一种来自环子孢子蛋白的重复四肽天冬酰胺酰-丙氨酰-天冬酰胺酰-脯氨酸(NANP),3种来自无性阶段抗原[一个来自裂殖子表面蛋白1(MerozoiteSurfaceProtein1,MSP-1),另两个来自恶性疟原虫血液期]。对十项Spf66功效试验总计9698例参与者的结果进行详细分析,结果发现,Spf66不能降低间日疟原虫(PlasmodiumVivax,P.vivax)疟疾或入院重症疟疾的爆发,同时试验也未发现Spf66疫苗存在任何严重的不良反应。并无理由进一步研究目前的Spf66制剂;可能应在南非对Spf66疫苗进一步开展研究或研发Spf66新制剂。人口增加速度过快是全球的公共卫生问题。避孕疫苗被认为是方便、安全、高效和价廉的方法。避孕疫