多肽类物质分离、分析的方法进展

多肽类物质分离、分析的方法进展

广泛应用于自然界的多媒体材料中，通常具有明显的生物活性。随着科学技术的快速发展，从自然产物中获得活性物质的分离分析方法也有所增加，出现了一些新方法和新理论。本文就近几年多肽类物质分离、分析的各种方法进展情况及其综合应用作一综述。1其他常用的提取方法多肽提取分离常用的方法,包括化学萃取法(如醇提、丙酮法)、水泡法、冻融法、酶解法、沉淀法、超滤法、离心法、逆流分溶法、层析法、电泳法等。在实际应用中,常常采用上述几种方法的组合对特定多肽类物质进行分离纯化。1.1铬技术1.1.1丝素肽的分离纯化(1)离子交换色谱(IEC)是按物质所带电荷的差异而加以分离的一种方法。可分为阳离子与阴离子两大类。根据所需分离的多肽类物质的性质选择适宜的离子交换剂与洗脱条件,对分离过程影响最大的两个因素是洗脱剂的PH值和离子强度。(2)凝胶过滤色谱(SEC)是利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽类物质的一种方法。倪莉将丝素经碱性蛋白酶水解后的酶解产物采用凝胶过滤色谱SephadexG-15分离纯化出丝素肽。(3)反相分配色谱(RPLC)是根据溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式。主要用于分子量低于5000的小分子多肽的分析和纯化。在RPLC中,肽的回收率一般在80%以上。甲状腺激素、神经毒素、神经肽、T-淋巴细胞趋化因子、抗菌肽、血管紧张素Ⅰ转化酶抑制肽、蝎毒素多肽均采用了RPLC进行纯化。1.1.2高效制备部分化合物高效制备液相色谱技术作为高效的分离纯化技术是纯化多肽类物质的一个最有力手段。尚庆坤等应用高效制备液相色谱法,分离虻虫中的多肽样品,制备收集了4种主要成分。经检测,各组分达到很高的纯度。由于80年代解决了载体制造中的刚性问题,色谱中的各种载体在HPLC中都能应用。1.1.3高效电分离微柱液相色谱毛细管电色谱(CEC)是近10年来结合了现代最新分离技术HPLC和毛细管电泳(CE)的优势而发展起来的高效电分离微柱液相色谱技术。它克服了CE选择性差的缺点,大大提高了液相色谱的分离效率。张锴等实现了梯度加压毛细管电色谱分离6种多肽。1.2微胶囊的分离毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳具有多种分离模式:毛细管区带电泳(CZE)、毛细管等速电泳(CITP)、毛细管等电聚焦(CIEF)等。应用毛细管电泳分离多肽类物质具有柱效高、分析时间短、所用样品量和试剂少等优点。黄志东等使用MECC在8min分离了7种肽类物质。与高效液相色谱相比,CE的制备总量低,只适用于微量制备;对扩散系数小的生物大分子而言,CE比HPLC的分辨率高得多,因此CE被用来作为收集非常纯的单一馏分的微量制备手段。2sds-采用鉴定与检测:常用方法主要有HPLC、HPCE、质谱、凝胶电泳等。性质、序列、结构分析:①等电点测定(CIEF技术)。②分子量测定(SDS和SDS-CGE)。③稳定性研究(HPCE辅以基质辅助激光解吸质谱法)。④氨基酸组成(Edman酶解、化学降解法或直接多肽特异酶解后经HPCE和HPLC分离进入氨基酸自动分析仪进行序列测定。)。⑤结构分析(质谱技术以及核磁共振、傅立叶红外转换光谱、圆二柱色谱等)。2.1肽图分析应用鉴定与检测多肽组分含量、纯度。肽图分析。已有多种多肽用HPLC进行了肽图分析,包括人生长激素、胰岛素等。多肽序列分析是肽图分析的重要应用之一。肽图上各峰经氨基酸分析并结合Edman降解或电喷雾质谱等手段,可得到每一肽段的精确序列。2.2气调与等电点分析多肽纯度的鉴定,与HPLC法相比毛细管电泳具有更高的分辨率和灵敏度,上样量也更少。有些纯化的多肽在凝胶电泳和HPLC上鉴定纯度为100%,但用HPCE分析纯度仅90%。应用CIEF技术可准确测定多肽的等电点。多肽的结构分析:毛细管电泳分离多肽酶解物所得的肽谱可提供多肽的结构信息。CE-MS联用技术可得到产品和消化产品的分子量和特征信息,甚至可测定一级结构。刘韬等建立了毛细管区带电泳-串联质谱联用(CZE/MS/MS)对多肽高灵敏度的鉴定方法。2.3质量分析ms2.3.1串联质谱质谱条件的研究是准确测定多肽化合物分子量的有效方法。由于不易获得碎片峰,其在测定多肽顺序时遇到困难,应用串联质谱可解决这一问题。李亢宗等用快原子轰击与质量分离离子动能谱(FAB-MIKES)技术测定了三个多肽中氨基酸的顺序。潘远江等通过快原子轰击质谱(FAB-MS)确定多肽分子量,在此基础上采用活化碰撞(CA)技术对氨基酸序列进行识别。2.3.2生物分子的分子量是靠强的电场使分子电离。电喷雾技术与串联质谱联用,不仅能测定生物分子的分子量,而且能确定多肽和蛋白质的序列信息。刘清萍等采用纳升电喷雾技术和碰撞诱导解离方法,在电喷雾-四极杆-飞行时间质谱上,对两种序列部分未知的天然多肽进行从头测序。2.3.3序列结构测定MALDI-TOF-MS技术具有操作简单、灵敏度高、质量分辨率高、测定质量范围宽等特点,非常适合生物分子和高聚物的分子量测定,还可以测定序列结构。季怡萍等将分离获得的马鹿茸所特有的多肽类物质采用MALDI-TOF-MS技术检测分子质量和纯度。MALDI-TOF-MS特别适合对混合蛋白多肽类物质的相对分子质量的测定。张珍英等考察了MALDI-TOF-MS测定多肽和蛋白质混合物的可行性。陈平等结合MALDI-TOF-MS测定酶解后缩短肽的质量,根据相邻两肽峰的质量差别读出蛋白质和多肽的C端序列。2.4磁共振成像nmrNMR可用于确定氨基酸序列、定量混合物中的各组分组成含量等分析中。3镇痛活性组分的分离纯化李丰等采用蛋白体抽提方法,再经硫酸铵分级沉淀、PPLCMonos阳离子交换层析和Superose12凝胶过滤层析等步骤从栝蒌籽中分离到一种新多肽,经MALDI-TOF-MS分析测得其分子量,并测出该肽的N端氨基酸序列。王春晓等采用CM-Sephadex离子交换色谱和Sephadex-G-50凝胶过滤色谱对浙江产眼镜蛇蛇毒中的镇痛活性组分进行分离纯化。采用PAGEIEF及HPLC对产物纯度进行鉴定。采用SDS和HPLC测定产物分子质量。用IEF测定产物等电点。孔景临等应用阳离子交换、凝胶过滤及高效液相等色谱方法分离纯化得到一种斛寄生多肽,MALDI-TOF-MS测定了质量数,用Edman降解结合酶解法确定了多肽完整序列。盛清凯等采用有机酸、醇提取,Sephadex