双歧杆菌对溃疡性结肠炎的预防和治疗作用

双歧杆菌对溃疡性结肠炎的预防和治疗作用

在过去10年中，中医诊断和治疗出现了进一步提高的趋势。这种病因和发病机制非常复杂。许多研究还没有取得突破，传统的水杨酸偶氮磺胺吡啶治疗无法控制的方法也无法达到令人满意的效果。因此，有必要进一步探索其发病机制，并找到新的预防和治疗机制。双歧杆菌(Bifidobacterium)是革兰阳性无芽胞厌氧杆菌,是人和某些哺乳动物肠道内主要正常菌群。许多研究证实,双歧杆菌具有抗感染、抗肿瘤、抗衰老、免疫赋活、促营养消化等作用,对维持人体健康至关重要。有研究表明,一些肠道病原体致病与双歧杆菌关系密切,临床也观察到用含双歧杆菌的微生态制剂对防治肠道感染有效。故本研究欲通过UC的动物模型观察肠道双歧杆菌的改变情况及双歧杆菌对UC的防治作用,从而为进一步阐明UC的发病机制以及预防和治疗UC提供新思路和新途径。一、肠球菌与双叉菌的分离和检测1材料和方法1.1实验材料1.1.1一名动物出生于7.8周，健康于威斯普白鼠,雄性,体重162g,由本校实验动物中心提供。1.1.2兔血红素缩合物vitk-pcr1.1.2.1改良BL培养基每升含牛肉汤1000ml,蛋白胨10g,胰胨5g,大豆胨3g,酵母浸膏6g,葡萄糖10g,可溶性淀粉0.5g,L-盐酸半胱氨酸0.5g,氯化血红素5mg,VitK110mg,土温80lg。用氢氧化钠调pH至7.2,8磅高压20min灭菌,分装备用。1.1.2.2BS平板BL液体培养基加2%琼脂15磅高压20min,待冷却至50℃左右,每100ml加10ml新鲜兔血,5mlBS添加剂,倾倒平板,备用。1.1.2.3BS添加剂每100ml无菌生理盐水中加丙酸钠30g,氯化锂6g,煮沸15min,冷却后加硫酸新霉素400mg,多粘菌素40mg,链霉素400U,二性霉素20mg。1.1.3微生物器材、光学显微镜普通培养箱,上海跃进;厌氧培养系统,大连市金中微生物器材开发公司;光学显微镜,Olympus,日本;所用试剂若无特殊说明均为国产分析纯。1.2耐氧试验分离取新鲜大鼠粪便3粒,用NS稀释成悬液,接种于BS平板,置于厌氧罐中37℃厌氧培养48h后,根据涂片染色及菌落特性进行分离纯培养,再根据耐氧试验菌落特性,形态染色镜检以及生化反应进行鉴定。2菌株生化鉴定于37℃有氧培养48h的BS平板上未见细菌生长,而37℃厌氧培养48h的BS平板上有单一菌落生长,挑取光滑突起的中等大小乳白色单个菌落,革兰染色后镜检,见均为单一的G+无芽胞杆菌,呈分枝生长趋势。再按照伯杰细菌鉴定手册(第九版)进行生长鉴定,结果:D-核糖(+),L-阿拉伯糖(+),乳糖(+),纤维二糖(-),松三糖(+),棉子糖(+),山梨醇(-),淀粉(-),葡萄糖酸钙(-)。生化反应结果与长双歧杆菌完全相符。将菌种通过分线传代的方法厌氧保存,用作制备双歧杆菌灌肠液。二、对溃疡性胃炎的微生态学研究以及双螺菌病的预防1材料和方法1.1实验材料1.1.1动物30只出生7~8周的健康Westar大鼠,雄性,(160±2)g,由本校实验动物中心提供。1.1.2菌株的培养和配制从Westar大白鼠粪便中分离鉴定的长双歧杆菌,于BS平板上厌氧培养48h增菌,使用时直接打开厌氧罐用0.9%生理盐水配成3×108CFU/ml浓度(用麦氏比浊管调整)并立即灌肠。1.1.3大鼠粪便稀释液稀释液的配制1.1.3.1改良BL培养基1.1.3.2BS平板1.1.3.3BS添加剂1.1.3.4粪便稀释液每升蒸馏水中加磷酸二氢钾4.5g,磷酸氢二钠6g,L-半胱氨酸0.5g,土温80lg。用氢氧化钠调pH至7.0,加琼脂1g,8磅高压灭菌15min,分装备用。1.1.4tnb诱导剂的配制吸取16ml5%TNB(2,4,6-三硝苯磺酸,2,4,6-Trinitrobenzenesulfonicacid,sigmachemicalco.st.Louis,Mo.)溶液,浓缩至5ml,加入5ml无水乙醇,配成每0.25mlTNB/乙醇溶液中含20mgTNB,乙醇浓度为50%的TNB/乙醇溶液,并选择20mgTNB作为诱导剂。其他试剂均为国产分析纯。1.1.5隐藏血样由广州市越秀东方新科技研究所生产。1.1.6微生物器材与仪器普通培养箱,上海跃进;厌氧培养系统,大连市金中微生物器材开发公司;光学显微镜,Olympus日本;麦氏比浊管,自配;天平,国产;多功能显微镜,Olympus日本;计算机扫描仪,美国惠普公司。1.2动物uc模型的诱导1.2.1动物分组及处理30只大鼠随机分成3组,每组各10只。A组为对照组,自由进食及饮水7d后,空腹24h,用乙醚轻度麻醉大鼠后,用微型注射器套上塑料管吸取0.25ml生理盐水经肛门导入结肠。B组为诱导组,自由进食及饮水7d后,空腹24h,采用Morris报道的方法,将0.25mlTNB/乙醇溶液导入大鼠结肠。C组为预防组,3×108CFU/ml大鼠长双歧杆菌灌肠7d后,空腹24h,采用Morris报道的方法用TNB/乙醇溶液诱导大鼠UC模型。1.2.2粪便标本的采集各组分别于处理前后收集每只大鼠粪便,做双歧杆菌培养和计数,粪便涂片革兰染色后的G+菌相对计数及每日做一次粪便隐血试验。1.2.3双歧杆菌培养方法和计数分别取每只大鼠粪便0.5g,加入4.5ml粪便稀释液中,将粪便搅成糊状,并振荡成匀浆,匀浆稀释度为10-1,以10倍稀释法递倍稀释成系列浓度至10-9。用12号针头滴管(47滴/ml),接种BS平板,每个平板做3个稀释度,每个稀释度滴3滴,涂布均匀,0.5h内迅速置于厌氧罐中,用抽气换气法37℃厌氧培养72h,观察双歧杆菌生长情况,根据菌落可数性选择计算菌落的稀释度。菌落计数为每克大便含双歧杆菌(CFU/ml)=每滴平均菌落×47×相应稀释倍数,以均值加减标准差(x¯±s)表示。1.2.4G+菌相对计数取每只大鼠粪便涂片染色,在油镜下数十个视野的G+菌和G-菌,并分别取均值,G+菌均值占G+菌和G-均值总和的百分率即为G+菌的相对计数值。1.2.5分别于处理前后每只动物进行称重,并每日观察动物与UC发病相关的临床表现,如毛发竖立、食量下降,活动减少,反应不灵活和/或大便性状改变等。1.2.6诱导大鼠产生UC7d后,全部处死动物,取出结肠置10%甲醛溶液中固定,先进行肉眼观察及拍照,再用常规石蜡包埋,切片,HE染色,Olympus多功能显微镜观察并摄影。1.3采用t检验方法进行统计分析2结果2.1不同处理前后动物体重的变化对照组和预防组处理前和处理后7d体重差异无显著性(P>0.05),诱导组在处理7d后体重极其显著性降低(P<0.01),见表1。2.2不同处理前后动物的双盲菌变化对照组和预防组处理前和处理后7d双歧杆菌数量差异无显著性(P<0.05),诱导组则极其显著性减少(P<0.01),见表2。2.3不同处理前后动物的相对计数变化对照组和预防组处理前和处理后7dG+菌相对数差异无显著性(P>0.05),诱导组则极其显著性降低(P<0.01),见表4。2.4诱导组患者处理前后粪便隐血试验对照组和预防组处理前后临床表现无异常改变,只是粪便隐血试验预防组2号和7号在处理后为阳性,第3天7号转阴,其余则在处理前后均为阴性。诱导组处理前粪便隐血试验为阴性,临床表现正常;处理后粪便隐血试验全为阳性,粪便外观均为血性稀便,临床表现均有不同程度的食量下降,活动不灵活,嗜睡,毛发竖立和呈绻缩状态。2.5组织病理学检测指标对照组肠壁基本上无异常改变,预防组仅2号发生轻微肠壁剥脱,5号和7号发生肠壁血管充血,7号还有部分出血点。诱导组全部发生点状出血、血管充血,肠壁有大小不等溃疡,10号还发生肠穿孔。病理切片计算机扫描图示对照组无溃疡形成,粘膜上皮细胞完整,无淋巴细胞浸润,预防组也无溃疡形成,只有部分粘膜上皮细胞坏死脱落,部分血管扩张充血,部分粘膜下有淋巴细胞增生且有淋巴滤泡形成;诱导组则均有溃疡形成,肠粘膜上皮细胞大部分坏死脱落,粘膜下均有淋巴细胞,浆细胞,嗜酸性粒细胞浸润,并可见肠壁血管全部扩张充血。三、双轩菌对溃疡性胃炎的治疗效果的观察1动物给予量c组1.1所用实验材料同前1.2动物分组及处理用TNB诱导30只雄性Westar大白鼠产生UC,随机分为3组,每组各10只。A组为治疗对照组,每日用生理盐水灌肠一次×7d;B组为常规药物治疗组,每日用18mg/ml水杨酸偶氮磺胺吡啶生理盐水灌肠一次×7d;C组为双歧杆菌治疗组,每日用3×108CFU/ml大鼠长双歧杆菌生理盐水灌肠一次×7d。1.3水杨酸偶氮磺胺吡啶广州白云山制药厂生产。按人与动物等效剂量折算公式:大鼠用量=人用量×0.18(人转换因子)10(大鼠转换因子)算出大鼠用量为90mg/200(g·d)。1.4各组分别于灌肠前及灌肠1周后做双歧杆菌活菌计数、G+菌相对计数、动物体重称量;每日做粪便隐血试验和动物体征观察;各组动物灌肠7天后活杀取出结肠进行肉眼观察和病理切片检查。1.5统计方法采用配对设计资料的t检验、对数似然比χ2检验,fisher精确概率检验法。2结果2.1常规药物治疗组p>0.05动物体重显著性增加治疗对照组灌肠前和灌肠1周后体重无显著性变化(P>0.05);常规药物治疗组灌肠1周后动物体重显著性增加(P<0.05);双歧杆菌治疗组灌肠1周后动物体重极其显著性增加(P<0.01),见表4。2.2双歧杆菌治疗后d后双歧杆菌数量治疗对照组和常规药物治疗组灌肠7d后双歧杆菌数量极其显著性降低(P<0.01),双歧杆菌治疗组则极其显著性升高(P<0.01),见表5。2.3治疗组的动物粪便g和g以及细菌相对数的变化。对照组为7d后G+菌相对数极其显著性降低(P<0.01),常规药物治疗组和双歧杆菌治疗组则极其显著性升高(P<0.01),见表6。2.4两组患者治疗前后双歧杆菌治疗前后临床疗效比较各组动物灌肠3d后的转阴率差异无显著性(对数似然比χ2=2.267,P=0.322);5d后则三组之间差异有极其显著性(对数似然比χ2=17.183,P=0.001),但常规药物治疗组与治疗对照组之间差异无显著性(P>0.05),而双歧杆菌治疗组与治疗对照组之间差异却存在极其显著性(P<0.01);7d后常规药物治疗组和双歧杆菌治疗组与治疗对照组之间差异均存在着极其显著性(P<0.01),见表7。2.5两组患儿粪便隐血阳性及半数值内容的比较,可减少大鼠小鼠卫生法治疗组d后的临床表现治疗对照组维持厌食、乏力等原状,常规药物治疗组除2例维持粪便隐血阳性外,其他体征均恢复正常,双歧杆菌治疗组则全部恢复正常体征。2.6两组不同病因部位感染造成的损伤d后各组动物结肠粘膜肉眼观察及病理切片检查治疗对照组结肠壁全都有内壁点状出血,血管充血水肿,肠壁有多个大小不一的溃疡形成。常规药物治疗组仅有2例尚有少许溃疡未愈合完全,其余仅见一些溃疡愈合后的痕迹。双歧杆菌治疗组肠壁几乎与正常无异,仅见个别溃疡愈合后残留的一丝十分不显眼的痕迹。病理切片计算机扫描图示治疗对照组有溃疡形成,肠粘膜上皮细胞坏死脱落,粘膜下淋巴细胞增生并有淋巴滤泡形成;常规药物治疗组无溃疡,粘膜固有层内有少数淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞浸润,极个别腺腔有灶性上皮坏死。双歧杆菌治疗组仅见粘膜上皮内灶性淋巴细胞浸润,其他无异常发现。四、讨论1产肠黏膜外源性双歧杆菌的作用机制双歧杆菌属于肠道正常菌群,所产生的定植阻力(colonizationresistance),对入侵病菌和潜在病原有较强抵抗作用。关于双歧杆菌对肠道病原体生物拮抗作用的机制,目前认为有以下几种可能:(1)双歧杆菌作为肠道优势菌,它的大量存在很容易在肠粘膜表面形成一层生物菌膜,抑制致病菌粘附到肠粘膜上,起到占位性保护作用;(2)双歧杆菌代谢过程中产生有机酸如乙酸、乳酸等,降低肠道pH和氧化还原电势(Eh),抑制致病菌繁殖;(3)调节和协同其他肠道菌群,促进肠蠕动,使致病菌粘附到肠粘膜上的机会减少;(4)产生抗菌物质,直接杀伤致病菌;(5)减少或弱化肠粘膜上皮细胞上致病菌和细菌毒素受体,使其致病作用受阻。关于外源性双歧杆菌在体内能否定植,定植多久的问题仍有争议。我们的实验采用从模型动物自身肠道分离鉴定的双歧杆菌作为探讨双歧杆菌防治UC功效的菌种,使菌种直接定植于模型动物肠道,从而有效地避免了外源性菌种定植问题的干扰,对于更加有效地探讨双歧杆菌的防病治病的功效具有十分重要的意义。2大鼠uc模型的建立UC的发病是复杂的、多环境、多因素的相互作用的结果,对它的研究很多,但其病因至今仍未完全明确,特别是感染因素的作用。有人报道温和气单胞菌引起溃疡性结肠炎,但更多的报道倾向于感染只是本病的诱发因素或继发于溃疡性结肠炎之后,例如黄永年等认为肠道正常存在的细菌,只要是由于某种原因某种细胞或菌体成分进入了血液,就有可能造成溃疡性结肠炎。Risberg等认为肠菌的组成或活性改变可能使肠粘膜更容易受到损伤。利用Morris等报道的方法建立大鼠UC模型,同时设对照组,我们发现模型建立后在伴随着体重极其显著性降低和粪便隐血试验阴转阳及发生一系列溃疡性结肠炎相关体征的出现的同时(包括结肠壁肉眼观察及病理切片检查),粪便双歧杆菌活菌计数值及G+菌相对计数值均极其显著性降低(P<0.01),而对照组则处理前后均差异无显著性(P<0.05),提示UC发生肠道微生态的改变,肠道微生态的变化可能是产生UC的诱导因素之一。由TNB产生UC的机制可能为TNB破坏了肠道的正常结构和正常菌群,使一些具有保护肠壁作用的G+菌数量减少(尤其是以双歧杆菌为代表的肠道G+的正常菌群减少),而一些具有诱发肠道发生溃疡结肠炎的G-菌大量增殖所致。3双歧杆菌诱导前、后转阴预先以从大鼠肠道分离并鉴定的长双歧杆菌配制的灌肠液对预防组灌肠1周后,用TNB诱导该组动物,我们发现,仅有2例粪便隐血试验阳性且3天后1例转阴,临床表现无异常改变,动物体重差异无显著性(P>0.05),双歧杆菌数量及G+菌相对数也与诱导前没有明显差别(P>0.05),仅有少数动物结肠壁肉眼观察及病理切片检查发现有轻微损伤。从理论上讲,用双歧杆菌灌肠1周后,双歧杆菌活菌计数值及G+菌相对数应有显著的升高,可能是定植的双歧杆菌在TNB诱导时被破坏掉,从而保护了结肠壁的正常结构及菌群免遭破坏。4双歧杆菌的药代动力学试验结果及效果由于双歧杆菌具有多重生理作用,临床已广泛应用双歧杆菌和以双歧杆菌为主要成份的微生态制剂治疗腹泻等疾病。本实验用双歧杆菌及常规治疗药物水杨酸偶氮磺胺吡啶对模型动物进行治疗,我们看到,常规药物治疗组经过灌肠1周后,尽管也达到了使动物体重增加(P<0.05)及临床表现恢复正常的效果,但仍有2例粪便隐血试验阳性,结肠肉眼观察仍可见一些溃疡愈合的痕迹且有2例有少许溃疡尚未愈合,病理切片检查可见有细胞浸润。灌肠5d后,粪便隐血阳性转阴率与治疗对照组仍差异无显著性(P>0.05),直至7d后才达到粪便隐血阳性转阴的效果(P<0.01),且常规药物不可避免地具有一定毒副作用。我们看到尽管双歧杆菌数量极其显著性减少(P<0.01),但G+菌相对数却极其显著性升高。而治疗对照组则发生双歧杆菌及G+菌相对数的持续下降(P<0.01),体重虽差异无显著性,但均值仍有继续下降的趋势,结合临床表现及粪便隐血试验,结肠肉眼观察及病理切片检查,说明治疗对照组继续维持病变且有进一步恶化的趋势。常规药物治疗该病的机制为杀灭溃疡区的所有微生物,促使溃疡面在自身修复机制的作用下达到治愈的