外周肺动脉栓塞后肺组织病理学及bfgf的变化

外周肺动脉栓塞后肺组织病理学及bfgf的变化

肺窒息是一种常见的临床疾病，具有很高的死亡率。近年来，肺血栓形成的诊断和治疗研究日益增多。但是,关于肺栓塞后机体修复栓塞肺组织之机制的研究,尤其是促血管生成因子在此过程中的作用少有报道。本研究通过制备周围性肺动脉栓塞动物模型的方法,探讨机体修复栓塞肺组织过程中碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)、肺小血管密度的变化规律。材料和方法一、双侧肺动脉造影由西安交通大学医学院动物实验中心提供8只北方杂种犬,体重13.0~18.0kg,平均15.6kg,以3%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后在DSA下沿股静脉、下腔静脉、右心房、右心室插入5F导管,导管头端置于主肺动脉水平。用高压注射器以5ml/s速度经导管注入泛影葡胺(1ml/kg),行双侧肺动脉造影。然后将导管头端插至一侧肺动脉干水平,用注射器经导管注入直径2~4mm、长10mm的明胶海绵4~6条,制备单侧周围性肺动脉栓塞的动物模型,以对侧肺的相同部位作自身对照。注入栓子后再次以相同的速度和剂量注入泛影葡胺,行肺动脉栓塞后动脉造影,以确定动物模型是否成功建立。二、组织病理学检查1.见20只犬随机不死犬肺动脉栓塞模型建立成功后,于栓塞后第1、7、14和28天分别随机处死2只犬。完整取出犬肺,根据DSA检查和尸体检结果,分别在栓塞区肺组织和对侧相应的非栓塞区肺组织各取10mm×10mm×5mm的组织,放入10%的甲醛溶液内固定2周。2.苏-伊红/免疫组化染色所取标本经脱水、透明、浸蜡和包埋等处理制成石蜡标本。常规切成6μm厚的组织切片,共3套,分别进行苏木精-伊红(HE)和免疫组织化学(免疫组化)染色。免疫组化染色采用两步法,多克隆兔抗人Ⅷ因子抗体和PV6000试剂盒购自Zymed公司,多克隆兔抗人bFGF抗体购自美国SantaCruz公司。3.增加小血管密度的检测方法(1)在HE染色组织切片上,观察肺组织随时间的变化情况。(2)取栓塞的36支肺动脉及对侧相应部位的肺动脉,共72支肺动脉行bFGF和Ⅷ因子染色。免疫组化bFGF染色组织切片上,以bFGF染色密集区域作为兴趣区,观察小血管内皮细胞bFGF的表达情况。具体方法:在40倍显微镜下随机选取3个视野,计数每个视野下的小血管根数。根据bFGF染色的强弱,将小血管内皮细胞表达bFGF的程度分为四级(分级标准参照随试剂附带的标准染色样片)。阴性(-):小血管的血管内皮细胞没有bFGF染色;弱阳性(+):血管内皮细胞可见轻微bFGF染色;阳性(++):血管内皮细胞可见bFGF染色;强阳性(+++):血管内皮细胞可见明显bFGF染色。分别计数不同bFGF表达水平的小血管数目,每组2只犬取其平均值。按照犬处死的时间顺序,比较栓塞区和非栓塞区bFGF表达的差异。(3)取栓塞的肺动脉进行免疫组化染色,另取对侧相应部位的肺动脉作为对照。在Ⅷ因子染色组织切片上对整个切片进行观察,以Ⅷ因子染色密集区域作为兴趣区,计数小血管密度。具体方法:在40倍显微镜下随机选取5个视野,人工计数每个视野下的小血管数目,将5个视野下小血管的平均数作为每个切片的最后结果。比较肺动脉栓塞后不同时间栓塞区和非栓塞区小血管密度的差异。三、血管密度和bfgf表达水平的比较肺动脉栓塞区和对侧肺非栓塞区肺小血管密度和bFGF表达水平的比较,采用SPSS10.0统计学软件包,行配对资料t检验和χ2检验。结果一、周围性肺动脉栓塞动物模型制备成功8只犬在复制肺动脉栓塞模型前、后均经DSA造影检查,证实周围性肺动脉栓塞动物模型制备成功。分别处死动物后,经病理解剖发现8只犬共栓塞了36支肺动脉,栓塞位置见表1。二、病理试验的结果1.栓塞前后肺组织形态的变化8只犬肺动脉栓塞模型均制备成功。肉眼观:栓塞后第1、7天肺动脉内可见明胶海绵,第14、28天未观察到明胶海绵(随栓子注入血管时间的延长,明胶海绵被逐渐吸收)。肺动脉栓塞后第1天,栓塞区胸膜下部分肺组织肺泡结构模糊、塌陷,并有大片出血,肺泡腔内有粉染蛋白样渗出物,并可见巨噬细胞、淋巴细胞和尘埃细胞浸润,肺泡上皮无增生,肺泡间隔增厚,间隔内小血管扩张、充血。栓塞后第7天,栓塞区肺泡腔仍可见粉染蛋白样物质,肺泡腔内浸润的巨噬细胞及淋巴细胞更多、范围更广泛,肺泡上皮未见增生,肺泡腔和肺泡间隔内可见大量红细胞渗出,肺泡间隔增厚;间隔内小血管增生、扩张、充血;细支气管轻度扩张,壁旁支气管动脉扩张充血。栓塞后第14天,栓塞区肺泡内粉染蛋白样物质较前明显减少、浸润的单核细胞和淋巴细胞亦较前明显减少,肺泡内和肺泡间隔内渗出的红细胞基本被吸收,肺泡间隔未见增厚,局部肺泡间隔内小血管轻度扩张。栓塞后第28天,栓塞区肺泡腔内粉染蛋白样物质及浸润的单核细胞和淋巴细胞均被完全吸收,肺泡腔和肺泡间隔内渗出的红细胞基本被吸收,肺泡间隔未见增厚,局部肺泡间隔内小血管轻度扩张。对侧健康肺组织在实验期各时间段表现相同,胸膜无明显增厚;肺支气管、细支气管内被覆纤毛柱状上皮,无增生及鳞状化生,管壁无增厚,个别管壁内小血管扩张、充血;肺泡壁无增厚,无小血管扩张、充血;肺泡上皮无增生,肺泡腔内无明显渗出;肺泡腔、肺泡隔以及细支气管壁见少数尘埃细胞(图1~5)。2.血管内皮皮细胞的形态血管内皮细胞可见bFGF表达,bFGF染色阳性的血管内皮细胞在光镜下呈棕黑色,沿血管内膜分布(图6~9)。犬肺栓塞后不同时间栓塞区与非栓塞区内bFGF表达水平的比较见表2。3.血管内皮皮细胞的分布Ⅷ因子特异地表达在血管内皮细胞上,染色阳性的血管内皮细胞在光镜下呈棕黑色,沿血管内膜分布(图10~12)。犬肺栓塞后不同时间栓塞区与非栓塞区之间小血管密度的比较见表3。栓塞后血管生成因子的表达当肺动脉发生阻塞后,由于血流的阻断,致使阻塞远端的血管壁通透性增加,血管内容物渗出到肺泡及肺泡间隔内;肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌肺泡表面活性物质减少,局部肺泡腔萎陷,形成肺不张等。未经治疗的肺栓塞患者,一种方式是通过纤溶系统的激活,将血栓溶解或分解,从而恢复阻断的肺动脉血流;而另一种方式则通过支气管动脉与肺动脉之间的侧支血管,将一部分体循环血液分流至缺血肺组织内,使缺血的肺组织恢复血供。以往的研究中发现,侧支血管的形成并不仅仅是血管管腔的简单扩大,还包括血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖。bFGF在这一过程中起着非常重要的作用。但当肺动脉发生栓塞后,支气管动脉和肺动脉之间侧支血管形成的过程中,是否有促血管生成因子的参与目前尚不清楚,因此需要研究证实。血浆中的Ⅷ因子主要由血管内皮细胞合成,血管壁中的成纤维细胞、平滑肌细胞都没有这种功能,因此,Ⅷ因子也常常作为一个特异性的标志,用来鉴定血管内皮细胞。有报道当肺动脉发生栓塞后,栓塞处远端肺动脉内压力降低,支气管动脉血流通过侧支血管供应缺血肺组织,侧支血管由于要容纳更多的血液,导致血流对血管壁的剪切力增高,激活了血管内皮细胞和血液中的单核细胞,启动血管的新生机制,血管内皮细胞合成并释放bFGF。bFGF具有很强的促血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖的作用,它刺激支气管侧支动脉增生和扩张。随着侧支血管数目的增加和管径的增大,每个侧支血管内的血流相对减少,血流对血管壁的剪切力降低,bFGF的表达也逐渐降低。但是,已增生的侧支血管并不消失,仍可对栓塞区肺组织进行供血。同时,