新冠核酸检测技术方案

1冠核酸检测技术方案为落实《国务院应对冠疫情联防联控机制关于做好冠疫情常态化防控工作的指导意见》〔国制造电〔2023〕14号〕和省应对冠疫情应急指挥部要求，进一步提升全省冠核酸检测力气，全面推动扩大核酸检测，使冠核酸检测保“量”保“质”保“安全”，为做好常态化疫情防控工作供给有力技术支撑,制订此技术方案。一、适用范围适用于XX省区域内开展冠核酸检测的试验室。二、生物安全防护要求〔一N95及以上防护口罩、全面型呼吸防护器或护目镜和面屏、医用防护服、防水隔离衣、工作服、工作鞋、乳胶手套、防水靴套、医用防护帽。〔二样本采集、样本核酸提取人员须三级生物安全防护：N95〔必要时可在外加戴医用外科口罩〕、医用防护帽、工作服、外着防护服〔必要时加戴穿防水隔离衣〕、工作鞋、防水靴套、双层乳胶手套、护目镜〔必要时可加戴面屏〕或全面型呼吸防护器。标本运输/接收人员须二级生物安全防护：工作服、工N95口罩、乳胶手套；特别状况时，可升级为三级生物安全防护。核酸扩增检测人员须一级生物安全防护：医用外科口罩、乳胶手套、工作服、工作鞋、医用防护帽。三、人员要求〔一〕把握试验室生物安全学问，生疏生物安全三级实验室个人防护操作。〔二〕试验室操作人员具备核酸提取和PCR扩增等分子生物学操作力气。〔三〕标本采集人员承受过冠标本采集操作培训，实验室检测人员承受过冠核酸检测技术培训。四、核酸检测试验室环境要求冠核酸检测试验室应至少设置三个区域：试剂预备区、标本制备区、核酸扩增区。各区域可以承受集中或分散设置形式，但物理空间上必需完全相互独立，各区域在使用中应当始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。标本制备区应为生物安全二级试验室，宜为负压。如为常压，应当可以通风换气，同时，必需设置缓冲区，以满足试验室个人防护装备穿脱的需求。五、核酸检测试验设备要求〔一〕试剂预备区。超净工作台，冰箱，混匀器，移液器，离心机。〔二〕标本制备区。冰箱，混匀器，移液器，生物安全柜，核酸提取仪，离心机。〔三〕PCR六、试剂耗材要求〔一〕核酸提取试剂和检测试剂需具备三证，并通试验室性能验证。〔二〕移液器枪头应为带滤芯枪头。七、标本采集〔一〕采集对象。需要进展冠核酸检测的个体。〔二〕采集预备。咽/鼻拭子、采样管、采样杯、三级生物安全个人防护装备。〔三〕采集标本类型。冠核酸检测的样本类型一般包括上呼吸道的咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子，下呼吸道的深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液和肺组织活检标本。为提高呼吸道样本的冠核酸阳性检出率，兼顾采样的便捷性，首选深咳痰，其次鼻咽拭子，最终才是咽拭子,也可同时采集同一人的鼻拭子和咽拭子并放入同一病毒采样液中。〔四〕标本采集方法。音。咽拭子越过舌根到咽后壁及扁桃体隐窝、侧壁等处。先用拭子适度用力来回擦拭双侧咽扁桃体至少3次，然后再咽后壁至少3次。取出拭子，避开触及舌头、悬垂体、口腔粘膜和唾液。将拭子头浸入含3ml采样液的管中。靠近顶端处折断无菌拭子杆，尾部弃去，旋紧管盖。〔约70保持不动。用入距离最少应达耳垂部位到鼻尖长度的一半。遇到阻力后即〔一般要求～应3～5有3ml采样液中。顶端处折断无菌拭子杆，尾部弃去，旋紧管盖。深咳痰液：用清水〔勿用含消毒剂的漱口液〕漱口2～3次，有假牙者取出假牙后漱口，要求病人深咳后，将咳出的痰液收集于采样杯〔含3ml采样液〔细胞保存液〕的50ml〕中。支气管灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管〔约30cm深处〕，注入5ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液冲洗收集器1次〔亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集〕。肺泡灌洗液：局部麻醉后将纤维支气管镜通过口或鼻经过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支管，将其顶端契入支气管分支开口，经气管活检孔缓缓参与灭菌生理盐水，每次30～50ml100～250ml300ml。送检标本管/杯外必需贴含样本编号、种类、姓名及采样日期等信息的识别条码。在采样记录单上同时记录并张贴识别条码。〔五〕标本运输。将密闭后的标本管/杯装入密封袋，每袋限一份标本，依次装入标本盒、冠专用标本转运箱，并保持标本直立，70%酒精消毒后封闭，并由专人转运到试验室。转运期间不能自行翻开转运箱，并保持转运箱平稳，避开猛烈震荡、颠簸。内部转运时，应采集之后30min内运抵试验室，不宜超过2h；涉及外部标本运输的，应依据标本类型，依据A类或B类感染性物质进展三层包装。宜冷藏条件下定时定点转8h。标本采集后应置于4℃24h。〔六〕标本保存。用于病毒核酸检测的标本应尽快进展检测，能在24小时内检测的标本可置于4℃保存；24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存〔如无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存〕。应设立专库或专柜单独保存标本。标本运送期间应避开反复冻融。〔七〕标本接收75%乙醇喷雾消毒。核实样本信息。八、试验室检验〔一〕冠核酸提取。在标本制备室，须2名试验室操作人员着生物安全三级个人防护装备进展病毒RNA提取，确保生物安全。进展核酸提取时，标本的开盖、取样或核酸的人工提取等操作都在生物安全柜内两人协作进展，检验操作过程中尽可能缩短翻开样本管盖的持续时间，轻柔操作，尽可能避开产生气溶胶。〔二〕冠核酸检测。推举选用针对冠的ORF1ab、N基因区域的引物和探针。靶标一〔ORF1ab〕:反向引物〔R〕：ACGATTGTGCATCAGCTGA荧光探针〔P〕：5”-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3”靶标二〔N〕:荧光探针〔P〕：5”-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3”RT-PCR相关厂家试剂盒说明。结果推断：CtCt≥40。阳性：Ct值<37，可报告为阳性。灰度区：Ct值在37-40之间，建议重复试验，假设重做结Ct<40，扩增曲线有明显起峰，该样本推断为阳性,否则为阴性。注：假设用的是商品化试剂盒，则以厂家供给的说明书为准。〔三〕阳性结果的认定。由卫生安康行政部门批准确实认试验室进展阳性样本确认检测；非确认试验室的结果阳性，须马上联系当地的疾控中心进展核酸结果确实认检测。试验室确认阳性病例需满足以下两个条件中的一个：同一份标本中冠2个靶标〔ORF1ab、N〕实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。假设消灭单个靶标阳性的检测结果，则需要重采样，重检测。假设照旧为单靶标阳性，判定为阳性。同种类型标本两次采样检测中均消灭单个靶标阳性的检测结果，可判定为阳性。核酸检测结果阴性不能排解冠感染，需要间隔1天后再次采样检测以确认。同时需排解可能产生假阴性的因素，包括：样本质量差，比方口咽等部位的呼吸道样本；样本收集的过早或过晚；没有正确的保存、运输和处理样本；技术本身存在的缘由，如病毒变异、PCR〔四〕检验后标本及相关废弃物处理需复查和上送的标本，应按规定保存和上送。否则和其他固体废弃物一起装入红色废弃物袋内密封，转运至高压灭菌室，高压灭菌。相关废液，承受化学消毒或物理消毒方式处理，并对消毒效果进展验证，确保彻底灭活。消毒灭菌后的标本转运出试验室需符合生物安全原则、符合感染治理标准。九、质量把握卫生安康行政部门批准同意开展核酸检测的试验室要进一步制定和完善冠试验室检测相关治理制