刺五加注射液致过敏反应类型的判断

刺五加注射液致过敏反应类型的判断

现在，中医口服合用的副作用通常包括皮疹、头晕、头痛、发热、心悸、胸闷、水肿和休克，通常发生在服用该药物后30分钟内。上述过敏症状可归类为急性过敏反应。多数学者将急性过敏反应分为Ⅰ型超敏反应和类过敏反应,前者由IgE介导,需多次致敏后激发才会产生过敏样症状,而后者症状的产生与IgE无关,且首次接触即可发生反应,二者临床症状类似,但作用机理完全不同。为了探讨刺五加注射液致敏反应类型,建立可靠、灵敏的致敏物质筛选方法,寻找防治刺五加注射液不良反应的途径和方法,本实验通过对刺五加注射液豚鼠致敏后血清总IgE、IL-4、IFN-γ水平、全血嗜酸性粒细胞的数量的测定,同时对各组致敏后豚鼠经抗原激发后的肺组织进行病理切片检查,确定刺五加注射液的过敏反应类型,为进一步研究其致敏物质基础提供实验依据。1试剂和仪器刺五加注射液(×××药厂提供,批号20100208、20100309、20100402、20100601、20100702、20100903);弗氏完全佐剂(Sigma公司进口分装);弗氏不完全佐剂(Sigma公司进口分装);卵白蛋白(Sigma公司进口分装);高速低温离心机(日本日立公司,R21型);涡旋混匀器(苏州捷美电子有限公司,HYQ-2121A型);豚鼠总IgE试剂盒;豚鼠IL-4试剂盒;豚鼠INF-r试剂盒;全自动生化分析仪(EBS-240型,淄博恒拓分析仪器有限公司);酶标仪(美国MolecularDevices公司,SPECTRAMAX190型);透射电镜(TECNAIG2型,荷兰);高速冷冻离心机(TGL16M型,长沙)。2药物安全性评价中心白毛豚鼠,英国种,雌雄兼用,体质量(280±30)g,清洁级,由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供,合格证号为SCXK(黑)2008004号。3实验方法3.1刺五加注射液冻干粉水不同规格将豚鼠随机分组,分别为阴性对照组(NS组)、阳性对照组(OVA1mg/只)、刺五加注射液冻干粉(自制)6个批号下分设低、高(15.4mL/kg、61.6mL/kg)两个剂量组,每组6只。3.2足掌及肘窝淋巴结致敏途径豚鼠适应性饲养5天后,将各组实验药物与弗氏佐剂以1:1混合,研磨均匀后分别注射于足掌及肘窝淋巴结周围,背部两侧、颌下、耳后等处,给药总体积为1mL/只,致敏途径为皮下注射,隔日1次,共免疫3次。每组分别于末次致敏后14天,心脏取血,室温自然凝固,6000rpm/min、离心20min,分离血清,置-20℃冰箱备用。3.3样品处理和加标采用豚鼠ELISA总IgE测定试剂盒,双抗夹心法对豚鼠抗血清中总IgE水平进行测定,记录各组OD值,具体步骤如下:分别设标准孔、待测样品孔。标准孔内加不同浓度的标准品,样品孔先加待测样本,再加样本稀释液,空白孔不加。除空白孔外,标准品孔和样品孔每孔加辣根过氧化物酶标记抗豚鼠IgE抗体工作液,37℃,60min。弃去液体,甩干,不用洗涤。温育60min后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,甩干。依序每孔加底物溶液,37℃避光显色。依序每孔加终止溶液,终止反应,用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的OD值。3.4标准曲线的绘制每孔分别加入豚鼠IL-4标准品或待测样品,将已包被好的酶标板充分混匀后,每孔中加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体。将反应板充分混匀后置37℃,60min,用洗涤液将反应板充分洗涤5次,滤纸上印干。每孔加入底物A、B液,置37℃暗处反应15min。每孔加入终止液混匀。用酶标仪在450nm测吸光度值。以各标准品的浓度为纵坐标,A值为横坐标,绘制标准曲线。将各待测样品的A值代入标准曲线,算出相应的浓度值。3.5标准曲线的绘制每孔分别加入豚鼠IFN-γ标准品或待测样品,将已包被好的酶标板充分混匀后,每孔中加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体。将反应板充分混匀后置37℃,60min,用洗涤液将反应板充分洗涤5次,滤纸上印干。每孔加入底物A、B液,置37℃暗处反应15min。每孔加入终止液混匀。用酶标仪在450nm测吸光度值。以各标准品的浓度为纵坐标,A值为横坐标,绘制标准曲线。将各待测样品的A值代入标准曲线,算出相应的浓度值。3.6敏感性大鼠血液中的酸性颗粒检测应用全自动生化仪对致敏豚鼠血清中的嗜酸性粒细胞数量进行测定,统计学软件对各组嗜酸性粒细胞的数量进行分析。3.7电镜观察试验豚鼠经各组抗原激发后进行解剖,取带有一小块支气管的肺部切片经过脱水、浸腊、包埋,最后HE染色,电镜下观察各组药物对豚鼠致敏后所致的肺、气管、细支管的形态学变化。3.8组抗血清中总ige、il-4、ifn-水平比较记录各组OD值及嗜酸性粒细胞数量,通过标准曲线计算各组抗血清中总IgE、IL-4、IFN-γ水平,以(ue0af±s)表示,SPSS16.0统计学软件进行t检验,以P<0.05为统计学上有显著性差异标准。4结果4.1标准曲线进行的测定采用ELISA法对各组致敏豚鼠总IgE、IL-4、IFN-γ各项指标测定,经标准曲线换算后的结果,如表1~3所示,嗜酸性粒细胞测定结果如表4所示。与空白组相比,阳性对照组及刺五加注射液(20100702)高剂量组致敏豚鼠血清总IgE、IL-4、IFN-γ具有显著性差异,但嗜酸性粒细胞数量未见显著性差异。4.2加大刺五加注射液治疗比较各组刺五加注射液与生理盐水组的豚鼠肺部病理切片发现,批号为20100702的刺五加注射液高剂量组豚鼠肺部出现肺泡壁毛细血管扩张充血,肺泡腔内有少量液体渗出,细支气管腔内有炎性渗出物,其周围可见淋巴细胞浸润等轻微病变;而生理盐水组肺泡壁毛细血管无明显充血,肺泡腔内无液体渗出,切片结果见图1。5致型过敏反应检测IgE是人体五种免疫球蛋白中含量最低的,IgE介导Ⅰ型变态反应抗体,生理情况下含量极低,在健康人群中呈偏态分布。血清中总IgE的测定对寻找过敏原及认定过敏反应类型具有重要意义,可以初步认定中药注射剂的Ⅰ型过敏反应。细胞因子是一大类能在细胞间传递信息,具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。IL-4由抗原或丝裂原刺激的CD4+T细胞产生,活化的肥大细胞亦可产生IL-4。IFN-γ由CD8+T细胞和某些CD4+T细胞产生,NK细胞亦可合成少量的IFN-γ,IFN-γ不仅抑制TH2型细胞产生IL-4,而且抑制IL-4对B细胞的作用,特别是抑制B细胞生成IgE。因此本研究选择了致敏豚鼠血清中总IgE、IL-4、IFN-γ水平做为Ⅰ型过敏反应的检测指标,判断刺五加注射液的致Ⅰ型过敏反应作用。采用ELISA法检测不同批次刺五加注射液致敏豚鼠后总IgE、IL-4、IFN-γ水平的变化。ELISA实验显示,经过免疫后某些批次刺五加注射液高剂量组豚鼠血清总IgE、IL-4、IFN-γ水平与生理盐水组比较,具有统计学差异(P<0.05)。病理切片结果显示,正常组豚鼠肺泡壁毛细血管无明显充血,肺泡腔内无液体渗出。某些批次刺五加注射液高剂量组豚鼠的肺部病理切片显示,肺泡腔内出现液体渗出、肺组织实变,肺泡壁毛细血管扩张充血,肺泡腔内