植物激素对小麦衰老过程中生理生化指标的影响

植物激素对小麦衰老过程中生理生化指标的影响

叶片退役是叶片生长发育过程的最后一步，对于植物的正常发育是必要的。旗叶是小麦关键源器官,在籽粒灌浆期,旗叶的衰老引起叶片以及整个植株生理生化代谢的改变,影响籽粒发育并最终限制产量。因此,研究小麦旗叶衰老过程中的生理生化指标的变化动态,对于延缓衰老进程,防止早衰发生,提高小麦产量有重要意义。植物的生长发育以及叶片衰老受植物激素的调控。脱落酸(ABA)在植物生理代谢活动中有重要作用,可减轻环境胁迫对植物的伤害,调控植物衰老。Hu等认为ABA能提高水胁迫环境下玉米幼苗的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性,提高叶片抗氧化能力。黄凤莲等发现ABA减缓低温胁迫下水稻幼苗SOD和过氧化物酶(POD)活性的降低,维持相对较高活性。Travaglia等指出外源ABA处理使小麦叶片保绿时间长,叶绿素降解延缓。研究表明,经ABA处理的叶片SOD和POD活性提高,膜系统稳定性增强,ABA可诱导产生膜蛋白。细胞分裂素类物质对作物抗氧化酶活性的影响已有研究报道,张海娜等用外源6-苄基腺嘌呤(6-BA)处理棉花,提高了下位叶的CAT活性,降低了细胞膜质过氧化程度;Liu和Huang试验发现,通过外源注射玉米素(ZR)有效减轻高温胁迫对匍茎剪股颖的伤害,ZR使SOD、CAT保持较高活性,同时降低MDA含量;邵瑞鑫等研究认为外源激动素能够维持玉米生育后期较高的叶绿素含量,维持叶绿体机构的稳定性而延缓叶片衰老;王彦荣等提出水稻叶片衰老受ZR和ABA平衡关系的调控。旗叶在灌浆期的衰老进程因品种的遗传差异而具多样性,刘洋等和罗培高等曾报道不同持绿型小麦的衰老进程,但不同持绿型小麦品种旗叶衰老进程及其激素调控机制还有待深入研究。本试验选用持绿型和非持绿型小麦品种进行花后叶面喷施ABA和6-BA处理,分析旗叶叶绿素含量、可溶性蛋白含量、丙二醛含量、内源激素含量和抗氧化酶活性等生理生化指标的动态变化,旨在研究不同持绿型小麦品种衰老过程中生理生化代谢差异,深入认识激素在抗氧化调控衰老上的作用机制,为生长调控及防止早衰提供理论依据。1材料和方法1.1供试项目及分组2010—2011年在山东泰安山东农业大学农学试验农场(36°9′N,117°9′E)进行田间试验。试验地耕层(0~20cm)土壤含有机质12.3gkg-1、全氮0.91gkg-1、碱解氮87.2mgkg-1、速效磷8.6mgkg-1、速效钾57.5mgkg-1。小区面积为9m2(3m×3m),随机排列。播种前施纯氮120kghm-2、P2O5100kghm-2、K2O100kghm-2,拔节期追施纯氮120kghm-2。供试品种为持绿品种汶农6号和非持绿品种济麦20,于2010年10月10日播种,种植密度均为225株m-2,2011年6月16日收获。生长期田间管理同一般高产田。于盛花期开始,每天16:00左右叶面喷施ABA和6-BA(美国Sigma公司),连喷4d。为使激素能更好地附着于叶片,喷施前将激素与0.5%(V/V)吐温-20(美国Sigma公司)混合配成10mgL-1,用量为100mLm-2。以喷施清水(含0.5%吐温-20)为对照,每处理3次重复,每重复为9m2。选各处理生长一致小麦植株挂牌标记,每7d取一次样,每次取旗叶20片保存于-40℃冰箱中。1.2测量设计和方法1.2.1绿叶含量用95%酒精20mL提取至叶片完全失绿,按赵世杰等的方法测定665、649和470nm波长下的吸光度,计算叶绿素含量。1.2.2可溶性蛋白质含量1.2.3sda包括参照赵世杰等的方法,用双组分光光度法分别测定反应产物在600、532和450nm下的吸光度,计算MDA含量。1.2.4simme生长曲线采用高效液相色谱法(HPLC)测定旗叶中4种内源激素的含量。流动相甲醇∶乙腈∶0.6%乙酸为50∶45∶5(V/V),所用分析柱为SymmetryC18(150mm×4.6mm,5μm),柱温为25℃,流动相流速0.6mLmin-1,检测波长为254nm。ZR、赤霉素(GA3)、生长素(IAA)和ABA标样均购自美国Sigma公司。1.2.5叶片sod、cat和pod活性用氮蓝四唑(NBT)光化还原法测定SOD活性,愈创木酚法测定POD活性,过氧化氢法测定CAT活性。1.2.6产量每处理收获1m2统计穗数,收获后脱粒、晾干和称重,计算产量,3次重复。1.3统计分析用DPS7.05软件对数据进行方差分析和显著性检验,用SigmaPlot10.0绘图。2结果与分析2.1持绿型品种在生育后期的叶绿素含量两品种旗叶叶绿素含量随植株发育进程呈降低趋势,花后7~14d迅速下降,花后14~28d相对稳定,之后又开始下降(图1)。汶农6号叶绿素含量高于济麦20,其中花后35d,汶农6号对照处理比济麦20高74.2%,表明持绿型品种在生育后期有较高的叶绿素含量,使旗叶有较高光合产物制造能力。外源ABA及6-BA处理,均能显著提高花后7~21d旗叶叶绿素含量,其中喷施ABA和6-BA后,汶农6号花后7d的旗叶叶绿素含量分别提高15.4%和27.8%,济麦20的旗叶叶绿素含量分别提高13.3%和17.2%,说明在花后喷施脱落酸和细胞分裂素能提高叶绿素含量,有利于延缓叶绿素降解。2.2aba对旗叶可溶性蛋白的影响两品种旗叶可溶性蛋白质变化趋势不同,汶农6号呈先降低再升高后再降低的趋势,而济麦20则呈升高—降低—升高—降低的趋势,但两品种旗叶可溶性蛋白质在花后28d有最大含量,之后迅速下降(图2)。汶农6号旗叶可溶性蛋白含量高于非持绿型济麦20,其中花后28d济麦20对照处理比汶农6号低16.5%。ABA处理后可溶性蛋白含量,在花后7~21d旗叶差异不显著,但在花后28~35d显著提高,其中汶农6号和济麦20花后28d分别提高18.8%和22.8%。外源6-BA处理则显著提高两品种旗叶7~35d可溶性蛋白质含量,其中花后28d汶农6号和济麦20分别提高33.7%和30.1%。2.3外源ba处理对旗叶mda的增加两品种小麦旗叶在衰老过程中MDA含量逐渐增加,花后7~14d积累较快,花后14~28d呈“V”字型趋势,花后28~35dMDA的积累加速(图3)。济麦20旗叶中MDA含量高于汶农6号,表明济麦20膜脂过氧化程度较高,持绿型汶农6号抗氧化能力强于济麦20。外源ABA及6-BA处理显著降低了两品种花后28~35d旗叶MDA含量。ABA处理后,花后35d汶农6号和济麦20旗叶MDA含量分别降低10.9%和17.7%,而6-BA处理后两品种分别降低26.3%和15.0%。2.4外源aba和6-ba对叶片内源激素含量的影响2.4.1济麦20的含量旗叶中ZR含量变化呈先降低后升高再降低的趋势,两品种具有相同的趋势,汶农6号旗叶中玉米素含量显著高于济麦20的含量(图4-A和B)。对照处理的ZR含量在花后21d达到最高,济麦20喷施ABA和6-BA的旗叶中ZR含量在花后28d达到最大,以后含量降低。喷施6-BA显著提高了两品种旗叶ZR含量,而喷施ABA降低了ZR含量,表明外源细胞分裂素能够促进内源ZR合成,而外源ABA则抑制ZR的合成。2.4.2外源aba应用效果在所有处理中,ABA含量呈先增高后降低的变化趋势,两品种旗叶内源ABA含量在花后21d达最大值,其中济麦20含量高于汶农6号(图4-C和D)。外源ABA处理显著提高了汶农6号花后14d旗叶ABA含量,但降低了花后28~35dABA含量。喷施ABA显著降低了济麦20花后21~35d旗叶ABA含量。喷施外源6-BA提高了汶农6号花后14~21d旗叶内源ABA含量,但降低了花后28~35d旗叶ABA含量。喷施6-BA显著降低济麦20花后14~35d旗叶内源ABA含量。2.4.3aba和6-ba处理对旗叶ga3含量的影响两品种GA3含量呈双峰变化趋势,在花后14d和21d含量相对较高。ABA和6-BA处理降低了汶农6号花后14d旗叶GA3含量,但提高了花后28d的GA3含量。ABA和6-BA处理提高了济麦20花后14~21d的GA3含量(图4-E和F)。2.4.4aba对旗叶iaa含量的影响旗叶中IAA含量变化呈先升后降趋势,两品种趋势相同,花后21d达到最大含量。喷施ABA显著提高了汶农6号花后7~28d旗叶的IAA含量,其中花后21d提高26.9%。ABA处理后显著提高济麦20花后21~28d旗叶IAA含量,其中花后28d提高21.1%。6-BA处理提高了汶农6号花后7~14d及提高济麦20花后7~21d旗叶的IAA含量,但显著降低了两品种花后28d旗叶IAA含量,汶农6号和济麦20分别降低56.6%和76.7%(图4-G和H)。2.5外源aba和6-ba对旗叶不同氧化酶活性的影响2.5.1aba和6-ba对旗叶sod活性的影响两品种所有处理呈先降后升再降趋势,即花后7~21d降低,花后21~28d提高,花后28~35d迅速降低(图5-A和B)。花后7~35d,汶农6号SOD活性显著高于济麦20,表明在灌浆期持绿型汶农6号能够保持较高的清除活性氧能力。ABA和6-BA处理均能显著提高两品种花后旗叶SOD活性,其中花后7~21d,汶农6号SOD活性保持较高水平,降低程度较对照有所减缓。不同激素处理在SOD活性保持上也存在一定差异,以6-BA处理的效果最好。2.5.2外源aba对旗叶pod活性的影响两品种旗叶POD活性随生育进程呈先升后降的单峰曲线,于花后21d达最大值,此前保持较高水平,其后持续降低。汶农6号POD活性高于济麦20。外源ABA显著提高济麦20花后7~28d旗叶POD活性,但未引起汶农6号旗叶POD活性的显著变化(图5-C和D);6-BA处理显著提高了汶农6号和济麦20花后7~35d旗叶POD活性,花后21d分别提高18.5%和51.1%。2.5.3花后21d在d两品种旗叶CAT活性随生育进程总体呈降低趋势,花后7~21d保持较高水平,而花后21d迅速降低。外源6-BA处理显著提高两品种花后7~21d旗叶的CAT活性,而外源ABA处理对旗叶CAT活性的影响未达到显著水平(图5-E和F)。2.6aba和6-ba处理的高产植物种和产量对照条件下汶农6号的千粒重和产量均显著大于济麦20,表明持绿型品种产量较高;叶面喷施ABA和6-BA显著提高了两品种的千粒重和产量,且ABA处理汶农6号的增产幅度明显大于济麦20,ABA和6-BA处理后汶农6号增产14.1%和6.2%,而济麦20仅增产5.3%和3.1%。ABA处理的增产效果好于6-BA处理。汶农6号对照处理的穗数显著低于济麦20,但汶农6号的穗粒数大于济麦20,ABA和6-BA处理后穗数、穗粒数没有显著差异(表1)。3aba和6-ba对生态酶活性的影响持绿型品种汶农6号的旗叶SOD、POD活性及叶绿素含量均显著高于非持绿型品种济麦20,而前者MDA含量低于后者,尤其灌浆后期汶农6号叶绿素保持较高水平,因而前者能够产生更多的光合产物,最终获得较高的粒重和产量(表1)。这与薛晖等的试验结果一致,即持绿型品种抗氧化能力较强,衰老延迟。叶片衰老是一种复杂的生理生化代谢过程,通常以叶绿素含量、可溶性蛋白质含量、MDA含量以及SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性作为监测指标。本试验结果显示随生育进程,两品种旗叶的叶绿素含量呈降低趋势,外源ABA及6-BA处理后叶绿素在灌浆前期(花后7~21d)保持较高水平,延缓叶绿素降解(图1)。研究表明,外源ABA能够诱导干旱胁迫下psbA基因转录加快PSII的D1蛋白的合成,而D1蛋白周转是保护光合机构的关键;外源6-BA处理能够维持叶绿体和基粒结构、形态的稳定,这表明外源ABA和6-BA均能维持叶绿体结构稳定,延缓叶绿素的降解。蛋白质是体内的重要组成成分,蛋白质降解是叶片衰老的基本特征之一。可溶性蛋白质含量的下降是蛋白酶活性升高导致蛋白质的水解加剧引起的。本试验中外源ABA显著提高两品种花后28~35d可溶性蛋白质含量,6-BA显著提高汶农6号花后21~35d以及济麦20花后7~35d旗叶的可溶性蛋白含量,可能是由于ABA和6-BA降低了蛋白酶活性。叶片衰老过程中,活性氧含量增加,膜脂过氧化产生MDA。植物体内有多种途径清除活性氧自由基,其中酶促系统中的SOD、POD、CAT等保护酶有关键作用,维持抗氧化酶较高活性可以延缓叶片衰老。本试验中ABA较低的浓度(10mgL-1)处理,即可诱导产生H2O2,H2O2能作为第二信使诱导抗氧化防护酶基因的表达及抗氧化防护酶活性的增高。也有研究显示外源ABA能直接诱导植物抗氧化防护酶基因的表达,提高玉米叶片细胞溶质抗氧化防护酶SOD和APX的活性。细胞分裂素类物质在植物抗氧化延缓衰老中已有研究报道,有人认为6-BA能减缓叶片中SOD活性的下降和MDA的积累,减轻细胞膜的损伤,也有人认为细胞分裂素类物质可直接清除氧自由基。本试验中外源ABA和6-BA显著提高了两品种旗叶的SOD活性(图5)。外源ABA对汶农6号POD、CAT活性影响没有达到显著性水平,但显著提高了济麦20花后7~28d的POD活性,而外源6-BA处理提高了两品种7~28d的POD和CAT活性,表明不同品种抗氧化酶活性对不同外源激素的响应有所差异,也表明外源ABA和6-BA能不同程度提高抗氧化酶活性,提高清除活性氧自由基能力,显著降低两品种花后28~35d的旗叶MDA含量(图3),降低膜脂过氧化程度。植物叶片衰老时激素水平发生改变。外源激素通过改变内源激素水平调节植物内在生理代谢的各个环节。细胞分裂素(CTK)、赤霉素(GA3)和生长素(IAA)延缓叶片衰老与其能抑制该过程中蛋白质水解酶和RNase活性上升、减缓蛋白质和核酸降解有关。有研究表明提高生育期IAA、ZR、GA3含量,能提高植株的生理活性,推迟急速衰老期的出现。CTK通过对基因表达的调节而影响植物的抗性和衰老。与衰老和逆境相关的基因大多被IAA所抑制。GA3