乌鲁木齐市奶牛结核菌素皮内反应检测结果分析

乌鲁木齐市奶牛结核菌素皮内反应检测结果分析

淋巴结是由分枝杆菌引起的一种重要的慢性传染病，在全世界范围内传播。这种疾病不仅损害了养牛业的可持续发展，而且损害了人类的身心健康。牛结核病OIE列为B类动物疫病,我国列为二类动物疫病。随着我国人民生活水平的提高,人们对牛奶和乳制品需求量的急速攀升,带动了奶牛业的迅猛发展,牛结核病也正日益受到密切关注。而且牛型和人型结核可互相感染,对人类健康构成巨大威胁。本文针对乌鲁木齐市奶牛和人结核病进行了流行病学调查和研究,基本掌握了其流行特点。1试验材料1.1材料、试剂与仪器精密电子天平、Sartorius高速冷冻离心机、恒温培养箱、超净工作台、显微镜,电子数显卡尺(杭州钱塘江工具量具有限公司,浙创01010157号,型号150mm/6in),微量金属注射器(报春鸟牌,2.5ml),电动推毛剪(深圳市宝安区沙井镇科德士电子厂,型号:CP-8000)。1.2比较全乳酸酯试剂国产牛PPD购于哈药集团生物公司(原黑龙江省生物制品一厂),批号20404;比较变态反应试剂包括进口牛型提纯结核菌素和Bovigam禽型提纯结核菌素购于北京测迪科技有限公司;BOVIGAMTM牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒,购于北京测迪科技有限公司。1.3染色溶液萋—尼氏(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法染色液。1.4培养基L-J培养基和改良L-J培养基。1.5实验动物来源于乌鲁木齐14个规模养牛场和8个区、县的散养户奶牛以及乌鲁木齐市与奶牛结核病相关的人员。2实验方法2.1内变量试验，牛结核菌素皮依据中华人民共和国国家标准《动物结核病诊断技术(GB/T18645-2002)》进行。2.2皮内主发酵试验与牛PPD变态反应试验相同,在注射牛PPD的同时,在牛颈部的另一侧同时注射进口的牛型和禽型PPD,两者间隔约12~15cm处,剂量分别为3000IU/头份和2500IU/头份。结果判定:对牛型结核分枝杆菌PPD的反应为阳性(局部有明显的炎性反应,皮厚差大于或等于4.0mm),并且对牛型结核分枝杆菌PPD的反应大于对禽型结核分枝杆菌PPD的反应,二者皮差在2.0mm以上,判为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性。对禽型结核分枝杆菌PPD反应大于对牛型结核分枝杆菌PPD的反应,两者的皮差在2.0mm以上,判为禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性。2.3-干扰检测2.3.1抗原刺激:每头牛采集5ml血液肝素抗凝血液,室温下于30h内运送到实验室。将采集的每份抗凝全血各取1.5ml加入3个不同孔中,然后取100μl的牛型PPD、禽型PPD和阴性对照磷酸盐缓冲液(PBS),分别加入至抗凝全血中,充分混匀后置于含5%CO2的培养箱中37℃培养16h。用移液器小心吸取培养的上清,转入至1.5ml离心管中,即为刺激产生的γ-干扰素上清。2.3.2牛γ-干扰素酶联免疫吸附试验(ELISA):单抗包被板上每孔加入50μl样品稀释液,然后加入50μl待测样品或对照,混匀后室温作用1h;洗涤,每孔加入100μl酶标抗体,室温作用1h;洗涤后每孔加入100μl底物,室温避光作用30min后,加入终止液,测定OD450nm值。当牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1,且牛型PPD刺激上清的OD值-禽型PPD刺激上清的OD值≥0.1视为阳性,反之为阴性。2.4耐药阳性标本的制备和判断2.4.1按照《全国结核病防治工作手册》和《中国结核病防治规划实施工作指南》的方法,对普通人群进行胸部X线检查。咳嗽、咳痰超过3周或有咯血的肺结核可疑症状者,胸透发现异常阴影及已知肺结核患者均摄胸部X线片;对胸透异常及有肺结核可疑症状者均收集3个痰标本(即时痰、夜间痰和次日清晨痰),3个痰标本进行涂片和对前2号标本培养,通过改良罗氏分类方法对培养阳性的标本进行菌型鉴定。2.4.2对结核病阳性牛密切接触人群和易感人群采用结核病PPD检测,PPD检测应在皮内注射结核菌素后72h观察结果。注射部位的红晕多系非特异反应,不作为判断标准,应以注射部位的硬结大小判断,硬结平均直径大于等于5mm者为阳性,10~19mm为中度阳性,大于等于20mm(儿童15mm)为强阳性,如硬结平均直径小于20mm但有水泡、坏死均为强阳性反应。然后对PPD阳性人群进行胸部X线检查,对胸透异常及有肺结核可疑症状者均收集3个痰标本,通过改良罗氏分类方法对培养阳性的标本进行菌型鉴定。3结果3.1立地条件检测结果通过对全市14个规模奶牛场和8个区县的47085头奶牛用国标PPD皮试变态反应(GB/T18645-2002)进行结核病检疫,结果见图1,表明:4年共检疫结核病奶牛47085头,检出阳性牛199头,阳性率0.42%。其中乌鲁木齐市辖区的14家规模奶牛场共检疫奶牛20667头,阳性率为0.52%,规模奶牛场2007~2010年结核病阳性率分别为0.37%、0.64%、0.55%和0.52%;乌鲁木齐市的4个区、县散养奶牛户共检疫奶牛26418头,阳性率为0.35%,2007~2010年阳性率分别为0.06%、0.63%、0.17%和0.32%,比规模养牛场的阳性率要低。3.2ppd皮内反应和-干扰实验的检测结果为了减少非特异反应,对项目区内的国内单纯颈部变态反应检疫的199头结核病阳性牛中的124头用发达国家通用的比较变态反应试验和γ-干扰素实验进行检测,结果见表1:从表1中可以得知国内PPD皮内变态反应和国外比较变态反应的符合率为68.59%,与γ-干扰素检测的符合率为79%。国外比较变态反应与γ-干扰素检测的符合率为86.4%。采用γ-干扰素检测和国外比较变态反应可剔除一部分禽型PPD阳性牛。3.3剖检结果对比阳性符合率国内单纯颈部变态反应检疫、国外比较变态试验、γ-干扰素试验和病理剖检结果对比阳性符合率结果见表2:从表2中可以看出观察到有病变的与γ-干扰素检测的符合率为96.2%,与国外比较变态反应的符合率为92.3%。证明了γ-干扰素检测和国外比较变态反应的特异性强。3.4病例新登记率及流行病学调查3.4.1对近4年的接诊结核病人17641例的进行流行病学调查和2000份的痰检阳性样品采用罗氏培养方法进行结核分支杆菌的分型。结果表明:2007~2010年4年间登记结核可疑症状者17641例,新发现活动性肺结核3887例,其中涂阳病人阳性率为52.3%。病人新登记率呈逐年上升趋势,涂阳病人新登记率变化较大。3.4.2对项目区域内与结核病阳性牛接触的人员及参与牛奶和奶牛交易的商业流通人员进行流行病学调查,主要针对畜牧兽医站的兽医工作人员、奶牛养殖人员和收奶人员等接触奶牛和生鲜奶的兽医工作人员及相关人员等95人进行了人畜间结核病调查,调查方法是人的PPD检测,对可疑结核阳性人群进行X光透视、镜检抗酸染色、痰液培养,鉴定人结核菌型,结果25例为PPD阳性,阳性率26%;对结核阳性及可疑人群中的20例进行X光透视,发现有1例(3岁)肺门淋巴有病灶,其余正常;对其中14例的痰液进行镜检抗酸染色及痰液培养,均为阴性,因其他原因,有6人未做痰检,其中包括X光透视在肺门淋巴有病灶的1例。3.5结核菌病毒分型中国农业科学院哈尔滨兽医研究所在送检的病料中共分离抗酸菌42株。其中,已鉴定出结核分枝杆菌复合物12株,包括6株结核分枝杆菌和6株牛分枝杆菌。结核分枝杆菌复合物分离率3.9%;结核分枝杆菌复合物占抗酸菌的百分率28.6%;抗酸菌分离率为13.6%。应用Spoligotyping和VNTR-MIRU分型方法对12株结核分枝杆菌复合物分离株的基因分型结果显示,12株结核菌分离株呈现出8种基因型,其中3株具有独特的基因型。存在结核分枝杆菌能够在动物中流行和传播的情况。中国动物卫生和流行病学研究中心从26头剖检阳性牛中分离到10株菌,提取10株分离株菌的DNA,先用IS1081和IS6110引物进行常规PCR扩增,扩增出248bp和317特异性片段后;再根据RichardC.Huard报道的结核分枝杆菌多重PCR方法结果的判定标准,用以16SRNA、Rv0577、IS1561Rv1510(RD4)、Rv1970(RD7)、Rv3877/8(RD1)和Rv3120(RD12)七对序列作为引物,对分离到10株菌进行PCR扩增,最后根据不同引物PCR产物的出现,大小是多少判定临床分离株的型,结果10株新疆临床分离株中8株牛型、1株牛分枝杆菌BCG型和1非特异性分枝杆菌。3.6人类抗病性的分离和发现对人的结核菌型鉴定,人型结核分枝杆菌占92.3%;牛型分枝杆菌占1.9%;非特异性分枝杆菌占5.8%。3.7市场上的成品奶牛和装样牛的鉴定对市场上成品牛奶、散装牛奶抽样98份,进行抗酸染色,对阳性菌进行培养和鉴定结核菌型,均为阴性。4牛病的防治方法对比4.1奶牛结核病流行病学特点:乌鲁木齐市牛结核病发病无明显的季节性;牛结核分支杆菌主要通过呼吸道、消化道方式传染,对此发病方式和发病率与养殖方式密切相关;规模场的发病率大于散养户的发病率;结核病的发病率与牛的品种相关,奶牛发病率较高;结核病的发生与牛的年龄有关,3~6岁的牛较小于3岁的牛发病率要高(3年检疫结核阳性中3岁以下的牛占25.6%,3岁以上的奶牛占74.4%)。检疫不严格,盲目引种,对检出阳性牛不能及时处理,未能从根本上消灭传染源。乌鲁木齐市牛结核病的发病与环境污染(主要是交通和车辆的影响)、活畜交易、畜及畜产品流通环节中的污染、饲养管理不科学、饲草饲料的污染、养殖人员自身疾病的影响和检疫净化的全面实施等相关。4.2方法比对试验证实,国外比较变态反应与γ-干扰素检测具有较好符合率,国内传统的PPD皮试变态反应检测方法其特异性较低。牛γ-干扰素试验已经成为很多发达国家的法定牛结核病检疫方法。γ-干扰素试验方法可以在实验室内进行,判定结果更为客观,而且与皮试相比,试验所需时间较短。在本实验中病理剖检与国内常规PPD变态反应符合率低,而与γ-干扰素试验及进口比较变态反应试验符合率高,也证明了γ-干扰素试验及进口比较变态反应试验的准确性。4.3人畜间相互感染等是造成牛结核病不断发生和流行的主要原因;生饮带菌的乳汁是人感染牛结核分枝杆菌的主要途径,随着牛奶在人们饮食中的比重加大,人的结核病发病率也在升高,流行病学研究显示,人、牛的结核病二者之间有流行病学相关性。5预防冠心病感染的方法5.1编制了《牛结核病防治技术规范》新疆地方标准,并将γ-干扰素实验作为国家规定标准PPD方法的补充实验,推广应用。以减少不必要的假阳性和假阴性。5.2制定流行病学调查方案,对利用PPD试验阳性奶牛的养殖环境和基本情况进行流调,填写流行病学调查表,对相关的人员进行流行病学调查和初步诊断。5.3对不同的结核病诊断方法进行对比试验,确定最合适本地的牛结核病检疫方法,提高结核病检出的准确率。5.4做好结核病防控具有明显的经济和社会效益。人、畜结核病的交叉感染是造成结核病不断流行的重要原因,尤其是在畜牧业发达的地区人畜间结核病的交叉传播,不仅对人类的身体健康造成威胁,而且也影响着畜牧业的快速发展。有效防控结核病,必将促进畜牧业尤其是奶牛业和肉牛业大发展,为社会提供更多的廉价、优质的肉和奶,保障人的身体健康和社会公共卫生安全。5.5关于结核菌素试验方法在结果判定时与个人操作水平密切相关,而且工作量大,耗时长,误差大,重复性差,操作繁琐,技术要求高,难度大,