基因工程第4章 目的基因的制备

6学时教学重点：基因组文库、cDNA文库及筛选文库方法的原理及操作规程。第一节目的基因的制备第二节目的基因的分离第四章目的基因的制备与分离1第一节目的基因的制备一、直接分离法1、限制性核酸内切酶酶切分离法已知序列基因.酶切后分离与适当载体重组转入受体。2plasmidBamHIBamHIPlasmid-132、物理化学法密度梯度离心法：不同大小的DNA被分开，再用探针杂交检验。单链酶解法：GC间三键，AT间双键，适当温度解开AT多的链，GC多的链未解开，用单链酶降解单链，剩下GC链。分子杂交法：利用探针分子通过分子杂交固定相关基因。是基因在发展初期所用的方法43、双抗体免疫法蛋白质已分离纯化，并制备了它的抗体1。mRNA合成蛋白质时与核糖体蛋白质结合形成聚合体。分离这种蛋白质聚合体，与制备好的抗体1进行免疫反应。再加入抗体1的抗体进行免疫反应。分离这种反应产物，再去除蛋白质，剩下mRNA，反转录后合成cDNA。56去蛋白提取RNA，反转录合成cDNAcDNA7二构建基因组文库从生物组织细胞提取出全部DNA，将DNA酶切成预期大小的片段，将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段,许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体.81、基因文库的概念某种生物的基因组的遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为这种生物的基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）92、基因文库的大小一个理想的基因组文库应该是在克隆群体中包含完整基因组的所有DNA序列。DNA片段要有足够的长度，保证含有某个完整的基因序列。估算：基因组文库的克隆数目=基因组DNA总长/DNA片段的平均长度。如：3×106kb/15kb=2×105

10经验值约比理论值大4.5倍。基因组越大，包含的克隆数越多，反之越少。113、构建λ噬菌体基因组文库的步骤对DNA进行随机切割，以获得一定大小的含目的基因的DNA片段。部分消化基因组DNA20kb的DNA片段12切割方法：物理学方法：机械力和超声波。生物化学法：酶切为满足切割的随机性，一般采用识别序列为4bp的限制酶。如Sau

3AI或Mbo

I等切后的片段可直接与BamHI酶切的载体连接。切割后通过凝胶电泳或密度梯度离心，回收一定大小范围的DNA片段。13与λ噬菌体克隆载体连接重组。噬菌体载体的酶切：两臂与中央片段相连处有SalI,BamHI和EcoRI酶切位点。两臂中原有的酶切位点被除去。采纳BamHI，因为该酶切产生的粘性末端与Sau3AI或MboI切割末端结构一样，采用Sau3AI或MboI酶解产生的DNA片段可直接与噬菌体的BamHI酶切位点连接。BamHI切割载体后，电泳或离心将两臂与中央片段分离，回收两臂。左臂右臂中央片段14在T4DNA连接酶的作用下载体两臂与外源DNA片段连接。15BamHIsitesLeftarmRightarmCOSCOSBamHICOSCOSLRCOSCOSLR回收16重组DNA分子在体外包装成噬菌体颗粒，转染宿主后铺板筛选培养，即可得到某种生物的基因组文库。1714/31重组的噬菌体体外包装18（1）、用Cosmid作载体构建基因组文库的优点：可容纳更大片段（30-45kb），文库中所需克隆数少。载体本身的分子很小，一般只有5kb，便于直接分析插入片段的酶切图谱。4、构建Cosmid质粒基因组文库19（2）、缺点：筛选困难：杂交检测难度大，携带外源片段大，复制困难，拷贝数少。重组效率低：大片段易出现机械性断裂而不具备粘性末端。文库不易贮存：噬菌体的重组DNA群体比含有Cosmid质粒的细菌菌落易贮存。20（3）、基因文库的构建过程与噬菌体载体文库的过程大致相似，区别有在外源DNA片段的分离要特别小心，防止断裂。载体处理时只须酶切，不须进一步分离酶切产物，去除中央片段。但酶切后要用碱性磷酸酶去5`磷酸防止环化。21连接重组时，载体量高出外源片段的10倍，保证外源片段最在限度地与载体连接。包装后的重组颗粒转染宿主时，在37度预吸附20min，加入1ml培养液，继续培养45min，再铺板，培养后出现的是菌落，不是噬菌斑。22YAC：酵母人工染色体适合克隆长达数百kb的大片段。常用的YAC载体为pYAC4。首先，用BamHIEcoRI双酶切载体，形成双臂，回收两臂。其次，制备生物完成DNA，用低浓度EcoRI部分消化，纯化后与YAC连接。然后转化去壁的酵母细胞，并进行筛选。5、构建YAC基因组文库2323/31外源基因EcoRI部分消化基因组DNADNA片段24基因组很大，有重复序列和非编码序列。通常表达基因占15%，产生约15000种mRNA。从mRNA分离目的基因更容易。可把mRNA反转录成cDNA，构建cDNA文库，从中分离目的基因。三、cDNA文库的构建及目的基因的分离251、cDNA基因文库的概念（1）、某生物基因组转录mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这样的群体称为该生物的cDNA文库。26（2）、缺点：只反映mRNA所携带的信息。不能反映内含子、启动子和终止子及核糖体识别mRNA相应的序列。只包含特定组织、特定发育阶段的基因。27（3）、优点：A、mRNA为材料，特别适用于RNA病毒。B、克隆数少，筛选比较简单。C、假阳性出现概率小。出现假阳性则有意义，可证明其它片段上也出现该基因序列。D、cDNA中无内含子序列可适用于原核生物的直接转化入表达。F、通过与基因组DNA文库比较，可用于分析真核基因结构、组织和表达。28（4）、分类：表达型：采用表达载体构建，插入的cDNA片段可表达产生蛋白，具有抗原性或生物活性。常用的：λgt11cDNA文库适用于蛋白质氨基酸序列未知的，不能采用核苷酸探针筛选的基因而用抗体或化合物进行筛选。29非表达型cDNA文库：适于采用核苷酸探针进行杂交筛选的目的基因的分离研究。常用的：λgt10cDNA文库核苷酸探针可从部分蛋白质序列中推测，人工合成寡核苷酸探针。30根据载体不同分为：质粒cDNA文库：包含克隆数少，适于高丰度的mRNA噬菌体cDNA文库：包含克隆数多，适于低丰度的mRNA。312、cDNA文库的构建包括以下几步:细胞总RNA的制备及mRNA的分离cDNA第一条链的合成双链cDNA的合成cDNA与载体的连接噬菌体颗粒的包装转染或质粒的转化。32（1）、分离细胞总RNA，纯化出mRNA。tRNA、rRNA和mRNAmRNA占总RNA的1-5%，种类繁多，分子大小不一。显著特征：3`端有poly(A)。用Oligo(dT）结合在纤维素柱上，带poly(A)的mRNA可结合在柱上，而其它RNA则不能，从而使其与其它RNA分开。33（2）、以mRNA分子为模板合成cDNA第一链：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，利用适当的引物合成的。引物：oligo(dT)引物：从3`端开始，适于较短的mRNA。随机引物：在mRNA的任何位置开始，适于较长的mRNA。34（3）、双链cDNA的合成：A、自我引导合成：用碱处理使mRNA-DNA杂交分子中的mRNA降解，cDNA第一链解离，单链cDNA3`端自身环化，形成一个发夹环结构。在DNA聚合酶的作用下产生一个完整的发夹结构双链cDNA，S1核酸酶将发夹切去，即可。缺点：S1酶会多切，而丢失信息。35AAAAAAAAAATTTTTAAAAATTTTT碱处理后，S1核酸酶引物结合逆转录酶DNA聚合酶36B、大肠杆菌RNaseH酶降解取代法：RNaseH酶可识别mRNA-DNA杂交分子，将其中的mRNA模板消化成许多短片段。这些短片段可作为引物，在DNA聚合酶作用下合成第二链cDNA，通过DNA连接酶将缺口补平。37AAAAAAAAAATTTTTAAAAATTTTTRNaseHDNA聚合酶+连接酶引物结合逆转录酶38C、oligo(dG)寡聚引物引导法在第一链cDNA分子尚未与mRNA分离之前，在其3`端加上一段oligo(dC)序列再碱性蔗糖梯度离心处理，使mRNA降解，回收全长cDNA再以互补oligo(dG)序列作引物，引导第二链合成。此法无发夹结构，不用S1核酸酶。39AAAAAAAAAATTTTT碱性蔗糖梯度离心，水解RNA回收cDNAOligo(dG)DNA聚合酶引物结合逆转录酶TTTTTCCCCC5`3`AAAAACCCTTTTTCCCCC5`5`5`CCCCCGGGGGTTTTT40D、PCR法：以cDNA的第一链为模板，设计一组引物，用PCR扩增获得双链cDNA。41AAAAAAAAAATTTTTAAAAACCCTTTTT碱性蔗糖梯度离心，水解RNA回收cDNA引物结合逆转录酶CCCCCTTTTTCCCCC5`3`5`5`5`SalCCCCCSalGGGGGTTTTTTTNotI加PCR引物SalI-GGGGGTTTTTTT-NotIAAAAAANotI42（4）、将cDNA双链重组到质粒或噬菌体上导入大肠杆菌宿主细胞。A、标准方法将cDNA甲基化。防酶切B、末端转移酶加尾或加适当的衔接头与适当方法处理的载体连接。C、将重组DNA转化大肠杆菌宿主。常用的载体是λgt10/λgt101，一般不用转化效率低的质粒。43AAAAAATTTTTTTEcoRI位点cDNAEcoRI甲化酶AAAAAATTTTTTTAAAAAATTTTTTTEcoRI衔接物DNA连接酶EcoRI酶切AAAAAATTTTTTTEcoRI位点EcoRI酶切cos位点cos位点cos位点cos位点连接后体外包装感染大肠杆菌4445表达型cDNA文库的构建演示24463、mRNA丰度与cDNA文库大小总mRNA中某种基因的mRNA数量越多，cDNA文库中贮存该基因工程概率越大，越容易分离。高丰度的mRNA构建较小的cDNA文库即可，反之，则构建大的文库。文库大小的理论公式：cDNA克隆数=细胞总mRNA数/某种mRNA的拷贝数细胞总mRNA数为500500个某种mRNA的拷贝数3500文库最小为500500/3500=143个47经验值是理论值的4.5倍左右48四、利用PCR扩增目的基因采用PCR进行DNA的克隆省时、省力，但要求对待扩增的DNA片段的序列必需已知，至少要求DNA片段的两端约20bp序列是已知的。PCR的有以下几种类型：491、套式PCR两对引物扩增同一样品的方法。从一个DNA模板的同一区域扩增出不同长度的片段而设计。外侧引物内部引物502、反向PCR酶切线性DNA模板连接成环，或加上接头后再连接成环。用另一种酶切环中已知序列上的酶切位点。利用已知序列设计引物PCR扩增出未知序列。51已知序列未知序列未知序列用限制性内切酶1去切连接环化已知序列中有1个限制性内切酶2的位点酶2切已知序列已知序列PCR523、长程PCR常规PCR扩增几kb长程可扩增10kb聚合酶：LATaq酶，EXTaq酶。模板纯度和完整性高引物长度30-35bp（常规20bp），浓度为0.1-1mmol/L（常规：0.2-1μmol/L）53反应程序：94℃1min，98℃20s68℃15min(复性及延伸)30循环544、反转录PCRRT-PCR提取RNA反转录合成cDNA以cDNA为模板进行PCR扩增。55五、人工化学合成

已知序列计算机控制的全自动核酸合成仪。56第二节目的基因的分离从基因文库中分离。57一、功能克隆1、根据特异蛋白分离目的基因方法一：分离特异蛋白测定氨基酸序列，推测基因核苷酸序列。合